阴道分泌物常规检测模式性能评价和复检规则分析

陆庭嫣 顾丹凤 王亚虹 葛亚芳 杨海鸥

（上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院检验科 上海市胚胎源性疾病重点实验室，上海 200030）

阴道分泌物显微镜镜检（白带常规）是女性细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）、外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）、滴虫性阴道炎（trichomonas vaginitis，TV）和炎症细胞评估的常规检验项目[1]。近年来，随着检验技术自动化和智能化的不断发展，白带常规检测经历了从人工镜检到半自动干化学分析，再到全自动有形成分联合干化学检测的发展过程[2-5]，检测效率逐步提升。然而，干化学酶检测具有局限性[6-9]，白带有形成分具有多样性[10]，为了验证和了解各种检测模式对疾病筛查的准确性和敏感性，本研究结合实验室现有仪器设备，对不同检测模式的临床漏诊率和实验室复检率进行分析，建立优选检测模式显微镜复检规则，并进行验证。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2021年2—5月上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院门诊患者阴道拭子1 334份，其中1 064份用于建立规则的样本不限制送检科室来源和患者年龄，连续随机纳入，每天不超过50份；270份用于规则验证的样本主要选自妇科门诊、宫颈门诊等阴道炎症患者较多的临床科室门诊，以确保小样本量情况下BV、VVC、TV的阳性验证需求。样本采集部位和方法参照第4版《全国临床检验操作规程》[1]。

1.2 仪器和试剂

重庆天海公司BD500白带检测分析仪和配套一次性计数板、清洗液。石家庄博洋生物科技公司阴道炎五联检试剂盒。郑州安图公司AutowoMO生殖道分泌物干化学检测仪和配套试剂。日本Olympus公司CX41光学显微镜。革兰染液（珠海贝索公司）。

1.3 方法

采集后的样本由专人负责处理，取样后1 h内完成检测。将仪器检测后的剩余样本混匀，用一次性滴管等量滴加2张玻片，1张用于人工镜检白细胞计数和线索细胞、菌丝/孢子、滴虫；1张待自然干燥后用火焰固定，行革兰染色镜检。2种镜检分别由1名有经验的检验技师双盲完成。根据说明书要求进行操作和结果判定。

1.3.1 参考方法

依据国内外相关指南[11-13]推荐的B V、VVC、TV诊断参考方法，本研究将湿片镜检联合革兰染色镜检（简称联合镜检）结果作为不同检测模式性能评估和复检方案验证的标准。湿片镜检判断标准依据第4版《全国临床检验操作规程》[1]，革兰染色镜检判断标准依据Nugent评分标准[14]。以湿片10个高倍镜视野均值为白细胞计数结果；革兰染色5～10个视野区域内Nugent评分≥7分为BV阳性；以湿片镜检或革兰染色镜检任一方法阳性为真菌菌丝/孢子阳性；滴虫以湿片镜检阳性为标准，但当镜下活动度减弱疑似不确定时，需补充核酸检测进行确认，并以核酸检测结果为准。

1.3.2 检测模式

模式1：阴道炎五联检；模式2：仪器法干化学酶检测；模式3：仪器法有形成分分析；模式4：仪器法有形成分分析联合阴道炎五联检；模式5：仪器法有形成分联合仪器法干化学酶检测。

1.3.3 3类初始复检方案

目前，我国阴道分泌物自动/半自动检测系统的显微镜复检方案相关文献较少，也缺乏相应的规范化文件可供参考。阴道分泌物有形成分和干化学检测的方法和原理与同为体液学检验领域的尿液有形成分和干化学分析极为相似，但又与尿液检测中细胞的定量分析要求不同：BV、VVC、TV相应病原体在阴道分泌物有形成分中的形态识别和确认是疾病筛查的重要依据。《阴道微生态评价的临床应用专家共识》[15]指出，若形态学检测与功能学检测结果不一致，以形态学结果为主要参考指标。本实验室基于阴道分泌物检测特性，并参考张时民[16]和吴晓华等[17]对尿液有形成分和干化学分析的基本筛检规则，设立了3类初始复检方案。

1）方案1。单独进行干化学检测时，BV、VVC、TV任一项目提示阳性时，进入显微镜复检程序。2）方案2。单独使用图像式有形成分分析仪时，线索细胞、真菌菌丝/孢子、滴虫任一有形成分阳性时，进入仪器图谱审核程序，如图谱阳性成分形态典型，直接判为阳性，反之判为阴性；若图谱阳性成分形态不典型或图像对焦不清晰难以辨别，则进入显微镜复检程序。3）方案3。有形成分分析和干化学酶检测联合使用，2种方法阳性结果相符或有形成分分析阳性而干化学酶检测阴性时，以仪器图谱有形成分结果为准，阳性形态典型者直接判断为阳性，错误识别者判为阴性，阳性形态非典型或图像不清晰难以辨别者进入显微镜复检程序。有形成分分析阴性而干化学酶检测阳性时：查看仪器图谱“未分类、上皮细胞、白细胞”分类栏是否有未被识别的阳性成分，如有典型的分类错误或未识别的阳性成分，则修正结果为阳性，若未发现相应阳性成分，则判为阴性。

1.3.4 显微镜复检程序

1）BV显微镜复检程序。湿片高倍镜镜检发现典型的线索细胞或大量的杂菌成团聚集（革兰染色可见Nugent评分≥7分的细菌成团聚集的特征，简称为BV相关细菌团），可以直接判断为BV阳性，反之为阴性；若湿片高倍镜镜检不典型或难以辨别线索细胞，则通过Nugengt评分进行二次确认。

2）VVC、TV显微镜复检程序。湿片镜检发现典型的真菌菌丝/孢子、滴虫者，可直接判断为VVC阳性、TV阳性；未观察到则为阴性。

1.3.5 不同检测模式性能评价

以联合镜检结果为标准，评价5种检测模式的敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率和符合率。选择敏感性、符合率最高的检测模式对相关疾病进行初筛。

对湿片镜检的白细胞计数结果和仪器法有形成分分析的白细胞等级进行一致性评估：仪器法有形成分分析白细胞分级阴性为0级，+为1级，++为2级，+++为3级；湿片镜检白细胞计数0～5个/高倍镜视野为0级、5～15个/高倍镜视野为1级、15～30个/高倍镜视野为2级、≥30个/高倍镜视野为3级。

1.3.6 优选检测模式复检规则的建立和验证

在初始复检规则的基础上，再对优选检测模式的假阴性结果进行分析，利用有形成分与干化学项目的对应关系，调整复检规则。在复检量可接受的情况下，加大仪器阳性报警提示，以降低假阴性漏检的概率，从而建立优选检测模式的复检规则。再根据国内外通用的复检规则评估指标[18-21]评估优选检测模式复检规则的真阳性率、假阳性率、真阴性率、假阴性率（漏诊率）和复检率，验证复检规则的临床适用性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计数资料以例或率表示，比较采用配对四格表χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联合镜检结果

联合镜检结果显示，用于建立复检规则的1 064份样本中，线索细胞/Nugent评分≥7分的BV阳性率为18.80%（200/1 064），真菌菌丝/孢子阳性率为14.10%（150/1 064），滴虫阳性率为1.03%（11/1 064），BV+TV阳性率为0.38%（4/1 064），BV+VVC阳性率为2.82%（30/1 064）。总阳性率为30.83%（328/1 064）。

2.2 仪器法有形成分分析和湿片镜检的一致性

仪器法有形成分分析与湿片镜检结果一致的样本有672例，一致率为63.16%（672/1 064），Kappa值=0.474。Kendall相关分析结果显示两者呈正相关（r=0.738，P＜0.005），Wilcoxon符号秩和检验结果显示白细胞分级差异有统计学意义（P＜0.001）。仪器法有形成分分析白细胞分级较湿片镜检平均高1级。见表1。

表1 仪器法有形成分分析和湿片镜检结果一致性分析 份

2.3 5种检测模式筛查BV、VVC、TV的性能评估结果

2.3.1 5种检测模式与联合镜检结果的一致性

5种检测模式中，检测结果与联合镜检检测结果一致性最高的是仪器法有形成分分析+仪器法干化学酶检测，最低的是单独阴道炎五联检。见表2。

表2 5种检测模式与参考方法的符合情况

2.3.2 5种检测模式筛查BV、VVC、TV的性能比较

5种检测模式筛查BV、VVC的敏感性、特异性差异有统计学意义（P＜0.001）。筛查BV敏感性最高的是仪器法有形成分分析+仪器法干化学酶检测，最低的是阴道炎五联检；筛查VVC敏感性最高的是仪器法有形成分分析+仪器法干化学酶检测，2种单独干化学检测模式（阴道炎五联检和仪器法干化学酶检测）敏感性均较低；5种检测模式筛查TV的敏感性、特异性均较高，差异无统计学意义（P=0.926）。见表3。

表3 5种检测模式筛查BV、VVC、TV的性能和总符合率 %

2.3.3 最优检测模式的确定和性能验证

以敏感性和总符合率最高的仪器法有形成分分析+仪器法干化学酶检测模式为最优方法，在初始复检规则的基础上分析该模式筛查3种疾病的真阳性率、假阳性率、真阴性率、假阴性率（漏诊率）、符合率和复检率，结果见表4。

表4 最优检测模式的检测性能

2.4 最优检测模式假阴性结果分析及其初始复检规则的调整

漏检BV的88份样本中，有16份仪器法有形成分分析未检出线索细胞；仪器法干化学酶检测脯氨酸氨基肽酶（±），但无报警提示；1份唾液酸苷酶弱阳性样本有报警提示，但图谱审核阴性。为降低BV漏检率，补充了1条复检规则，见表5规则4。63份漏检VVC的样本中，有12份仪器法干化学酶检测乙酰氨基葡萄糖苷酶（+）或（±）、葡萄糖苷酶和凝固酶同时（+）或（±），且提示VVC或TV阳性报警，但仪器法有形成分分析均未检出真菌菌丝/孢子、滴虫，仪器图谱审核也未发现阳性成分。为降低VVC漏检率，补充了1条复检规则，见表5规则5。

表5 最优检测方法复检规则

2.5 复检规则验证

270份样本验证结果提示，有67份需复检，其中9份需行革兰染色复检BV，总复检率为24.81%（67/270），假阴性率较初始规则低。复检规则验证结果见表6。

3 讨论

传统的湿片镜检白带常规是筛查女性下生殖道感染性疾病（BV、VVC、TV）和炎症评估最简单、经济的方法。但当样本量增多、操作人员的阅片压力增大时，阅片经验会对检测结果造成影响。为解决这一问题，适用于大样本量的各类半自动/全自动分析系统越来越多地应用于临床。

图像识别式白带有形成分分析仪采用光镜高倍（40×10）分辨率形态学检查原理，通过计算机软件对图像进行图形比对，识别各类有形成分，并分类、计数[22]。然而，白带成分的多样性、复杂性，以及高倍镜下细胞、菌群识别能力的局限性，会导致某些成分的漏判或误判。

阴道分泌物干化学分析仪基本均可测定阴道酸碱度、评估乳酸杆菌功能、检测微生物代谢产物。对于BV、VVC、TV的判断主要是测定其相对应的阴道微生物代谢产物和酶的活性[23]，但是某些标记的酶多种微生物均能产生，如氨基葡萄糖苷酶在滴虫和白念珠菌中均存在，只能依据pH值来区分[24]。但pH值的检测结果往往又受到阴道冲洗、阴道给药、经期、试纸质量、标本放置时间等较多因素的影响[25]，可能会导致错误的阳性提示。

本研究设计了5种白带常规检测模式，基本涵盖了临床实验室常用的阴道分泌物自动/半自动分析模式。通过参考方法的评估，最终证实仪器法有形成分分析+仪器法干化学酶检测模式筛查BV、VVC、TV的敏感性和符合率优于单独的干化学检测或单独的有形成分分析，通过建立联合检测模式复检规则，可进一步降低假阴性率。联合检测的优势在于仪器有形成分的自动识别和分类大大减轻了人工镜检的视觉疲劳和操作人员的主观性识别差异，扫描成像的各成分形态图谱可自动分类并进行溯源回顾，有助于对阳性结果的确认审核；而搭配了干化学酶法的相对应项目阳性报警又能弥补仪器有形成分识别分类错误或漏检的可能。但是仪器法干化学酶检测的检测能力可能会因试剂品牌有较大差异，且不同检测原理的有形成分分析仪间形态识别能力也可能会存在差异。不同实验室使用不同的仪器、试剂和检测方法时，应依据可行标准评估不同仪器特性和不同检测方法的敏感性、特异性，制定个性化的复检规则，尽可能降低临床漏诊率。

值得强调的是，参考方法对于不同检测方法敏感性、特异性的评估是至关重要的，不能简单地参照尿液检测仪器评估的方法，仅仅以湿片镜检结果做为参考。2018年，BV诊断欧洲指南[11]指出：革兰染色镜检是诊断BV的参考方法，虽然Amsel临床标准中湿片高倍显微镜下的线索细胞与革兰染色结果密切相关，但其敏感性低于革兰染色镜检，因而仅以湿片镜检为参考会造成BV的漏检。对于VVC的诊断，2018年欧洲指南[11]和2012年我国VVC诊治指南[12]均指出：阴道分泌物湿片和革兰染色镜检检出芽生孢子、菌丝或假菌丝都可诊断VVC，且革兰染色镜检敏感性略高于湿片镜检，基于此，本研究以联合镜检中任一种方法阳性为阳性标准，结果显示，湿片镜检与革兰染色镜检筛查BV的敏感性、特异性差异均有统计学意义（P＜0.001），筛查VVC仅敏感性差异有统计学意义（P=0.031），进一步验证了本研究参考方法选择依据的正确。对于TV的诊断，2018年欧洲指南[11]和2020年美国妇产科医师学会指南[13]均指出：显微镜检查阴道分泌物悬液观察阴道毛滴虫是当前最常用来诊断TV的方法，但敏感性只有45%～60%，推荐通过核酸检测诊断TV。基于此，本研究确认将2种镜检方式的结果联合判断可保证参考方法的准确性，且必要时补充核酸检测确认TV。

参考方法的验证为选择BV、VVC、TV的显微镜复检方式提供了依据。BV的显微镜复检仅单纯依靠湿片高倍镜检难以准确识别线索细胞，因为有些细菌，如大量的阳性球菌或阳性杆菌也会有上皮细胞的黏附现象，只有革兰染色油镜观察才能避免线索细胞假阳性，故本研究确立了BV的显微镜复检方式为：湿片高倍镜下难以鉴别时，行革兰染色二次确认。本研究发现，虽然革兰染色后，识别真菌菌丝孢子较湿片更容易区分VVC，敏感性也略高于湿片镜检，但2种镜检方式的特异性差异无统计学意义。为了使复检规则更适用于实际操作，本研究设定了VVC、TV的显微镜复检只需要湿片低倍镜或高倍镜识别确认即可。

本研究中，仪器法有形成分分析的白细胞分级较湿片镜检平均高1级，常见原因为：1）基底层小圆上皮细胞在人工镜检时较容易被区分，但仪器计数时因其大小与白细胞相近，可能被误判为白细胞；2）某些BV阳性的样本中杂菌黏附成团的BV相关细菌团易被仪器误判为白细胞。提示在仪器法有形成分分析白细胞计数等级与白细胞脂酶等级相差较大时，需通过图谱确认或显微镜复检确认。

综上所述，现有仪器法干化学酶检测联合仪器法有形成分分析可以有效提升BV、VVC、TV检测敏感性、降低复检率。联合镜检更适用于BV、VVC、TV的复检确认。