血清miR-150-5p 和LTBP-2 检测在急性脑梗死患者病情评估中的价值

薛亚泽 何 劲 唐绍军

（义乌復元私立医院神经内科，浙江 金华 322000）

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是脑组织血液供应不足引起的局部缺血和缺氧所导致的一系列神经功能障碍症状，其致残和致死率较高[1]。目前，ACI常用的诊断方法为电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），但对于早期有缺血病灶和体内有金属支架的患者存在一定的局限性，因此有必要寻找更有效的检测指标。另外，ACI的病情复杂多变，临床亟需可有效监测病情严重程度的指标[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）可通过结合mRNA的3'-非翻译区来参与调控靶基因的表达，其在血清等体液中以稳定形式存在，因此可通过检测其表达来评估机体的生理病理状态。有研究结果显示，老年急性缺血性脑卒中患者血清miR-150-5p水平异常降低，且与神经功能缺损程度有关[3-4]。潜伏转化生长因子结合蛋白（latent transforming growth factor-beta binding protein，LTBP）2作为LTBP家族成员之一，在机体动脉损伤、弹性纤维凝聚和细胞黏附中具有重要作用。有研究结果显示，冠心病患者血清LTBP2水平显著升高，可能参与了冠心病的发生[5]。冠心病具有和ACI相似的发病机制，均是由血流受阻造成细胞缺血、缺氧，最终导致组织器官坏死。LTBP2与ACI发生的关系尚未见报道。因此，本研究拟探讨ACI患者血清miR-150-5p和LTBP2水平与ACI病情严重程度的关系，以期为ACI的临床监测提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年5月—2021年2月义乌復元私立医院确诊的ACI患者121例（ACI组），其中男67例、女54例，年龄（62.01±7.36）岁。纳入标准：1）符合ACI临床诊断标准[6]；2）经CT或MRI确诊；3）初次发病。排除标准：1）有恶性肿瘤史；2）合并意识障碍；3）近期进行过手术或有创伤史。根据ACI患者发病48～72 h内的脑梗死体积，分为小梗死（梗死体积≤4 cm3）组（38例）、中梗死（梗死体积为＞4～≤10 cm3）组（43例）、大梗死（梗死体积＞10 cm3）组（40例）；采用美国国立卫生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）[7]评估ACI患者神经功能缺损程度，将ACI患者分为轻度（NIHSS评分＜5分）组（40例）、中度（NIHSS评分5～20分）组（42例）、重度（NIHSS评分＞20分）组（39例）。选取同期义乌復元私立医院体检健康者128名（正常对照组），其中男70名、女58名，年龄（60.27±8.49）岁。纳入标准：无基础疾病，体格检查和相关实验室检测提示身体健康。2个组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经义乌復元私立医院伦理委员会批准（2021042912），所有研究对象及其家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

反转录试剂盒（货号638314）购自上海百赛生物技术股份有限公司。荧光定量PCR试剂盒（货号T427S/L）购自广州英赞生物科技有限公司。总RNA提取试剂盒（货号AR1200-50T）购自上海吉至生化科技有限公司。Lepgen-96实时荧光定量PCR仪购自北京乐普诊断科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集和样本采集

收集所有研究对象的一般资料，包括年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）、饮酒史、吸烟史、高血压史。采集ACI患者入院6 h内和正常对照组体检当日清晨空腹静脉血5 mL，1 007×g离心15 min，分离血清，-80 ℃保存待测。

1.3.2 血清miR-150-5p及LTBP-2 mRNA检测

采用总RNA提取试剂盒提取血清样本中的总RNA，采用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应。引物由深圳华大基因公司设计、合成，引物序列见表1。分别以U6和β-actin作为miR-150-5p和LTBP-2的内参。反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s，65 ℃退火延伸45 s，40个循环。反应体系：cDNA（50 ng/μL）2 μL，SYBR Green Master Mix（2×）10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，加ddH2O至20 μL。采用2-ΔΔCt法计算miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量。

表1 引物序列

1.3.3 Targetscan网站预测

采用Targetscan在线软件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-150-5p与LTBP-2之间的结合位点。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，2个组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。采用Pearson相关分析评估ACI患者miR-150-5p与LTBP-2的相关性。采用Logistic回归分析评估ACI发生的影响因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACI组与正常对照组一般资料比较

ACI 组与正常对照组BMI、饮酒史、吸烟史、高血压史差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 ACI组与正常对照组一般资料比较

2.2 ACI组与正常对照组血清miR-150-5p和LTBP-2相对表达量比较

与正常对照组比较，ACI组血清miR-150-5p相对表达量显著降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相对表达量显著升高（P＜0.001）。见表3。

表3 ACI组与正常对照组血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量比较

2.3 不同梗死体积ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量比较

小梗死组、中梗死组和大梗死组血清miR-150-5p相对表达量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相对表达量依次升高（P＜0.001）。见表4。

表4 不同梗死体积ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量比较

2.4 不同NIHSS评分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量比较

轻度组、中度组和重度组血清miR-150-5p相对表达量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相对表达量依次升高（P＜0.001）。见表5。

表5 不同NIHSS评分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量比较

2.5 ACI患者血清miR-150-5p与LTBP-2的相关性

Targetscan网站预测结果显示：miR-150-5p和LTBP-2之间存在结合位点，见图1。LTBP-2是miR-150-5p潜在的靶基因。

图1 miR-150-5p与LTBP-2的结合位点

Pearson相关分析结果显示，ACI组血清miR-150-5p表达与LTBP-2表达呈负相关（r=-0.346，P＜0.001）。见图2。

图2 ACI患者血清miR-150-5p与LTBP-2 mRNA表达的相关性

2.6 ACI发生的危险因素分析

将是否发生ACI作为因变量（未发生=0，发生=1），miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相对表达量作为自变量（赋值均为实测值）。多因素Logistic回归分析结果显示，miR-150-5p表达降低、LTBP-2 mRNA表达升高是ACI发生的危险因素[比值比（odds ratio，OR）值分别为0.563、1.698，95%可信区间（confidence interval，CI）分别为0.445～0.712、1.342～2.148]。见表6。

表6 ACI发生的危险因素分析

3 讨论

动物实验结果显示，促进血管生成有助于恢复血液供应，促进大脑恢复，改善小鼠脑缺血情况[8-9]。miR-150-5p是一个相对保守的miRNA，在调节血管生成中具有重要作用。有研究发现，中风模型大鼠脑组织和血清中miR-150相对表达量异常降低[10]。大鼠骨髓来源的内皮祖细胞可分化成血管内皮细胞，并分泌多种促血管生成因子，以此促进缺血组织中血管新生，miR-150过表达可提高内皮祖细胞的成管能力，除此之外，内皮祖细胞迁移至深静脉血栓中还可促进血栓再通，而miR-150高表达能显著提高细胞的迁移能力[11]。还有研究发现，缺血性脑卒中患者外周血miR-150-5p相对表达量显著低于正常对照组（P＜0.001），与缺血性脑卒中的发生密切相关[12]。本研究结果显示，ACI组血清miR-150-5p相对表达量显著低于正常对照组（P＜0.001），且随梗死体积和NIHSS评分的增加而降低（P＜0.001），表明miR-150-5p参与了ACI的发生，并随疾病严重程度增加而显著降低，有作为ACI监测指标的潜能，连续监测或可用于判断疾病进展程度。

LTBP-2作为细胞外基质糖蛋白，在心脏、大脑中均有表达，其在血管内皮损伤和弹性纤维凝聚等方面具有重要作用[13]。冠心病患者血清LTBP-2相对表达量随疾病严重程度加重而升高[14-15]。冠心病和ACI作为心脑血管疾病中的两大主要疾病，均是由细胞缺血、缺氧造成组织坏死所导致的，因此本研究检测了ACI患者血清LTBP-2的表达情况。本研究结果显示，相较于正常对照组，ACI组血清LTBP-2相对表达量显著升高（P＜0.001），并随梗死体积和NIHSS评分的增加而升高（P＜0.001）。表明LTBP-2同样参与了ACI的发生、发展，其相对表达量与疾病严重程度密切相关，这为ACI的发生和治疗的机制研究提供了一个新的研究方向。

本研究通过靶基因预测发现LTBP-2是miR-150-5p潜在的靶基因，两者呈显著负相关（r=-0.346，P＜0.001）。提示miR-150-5p与LTBP-2可能共同参与了ACI的发生。因此，miR-150-5p参与ACI的发生可能与调控LTBP-2表达有关。本研究多因素Logisitc回归分析结果显示，miR-150-5p低表达和LTBP-2高表达均是ACI发生的危险因素（OR值分别为0.563、1.698，95%CI分别为0.445～0.712、1.342～2.148）。提示miR-150-5p和LTBP-2与ACI的发生密切相关，因此，miR-150-5p和LTBP-2或可作为ACI临床监测指标。

综上所述，ACI患者血清miR-150-5p呈低表达，LTBP-2呈高表达，二者与疾病严重程度密切相关，或可作为ACI病情监测的参考指标。本研究为寻找ACI临床监测指标提供了一个新的方向，但还需对ACI患者进行随访，观察患者预后和转归情况，以期为ACI患者的预后评估提供更全面的参考。