HIV-1 新型重组毒株近似全长基因组结构鉴定分析

路新利 刘 勇 李 岩 王莹莹 安 宁 刘 萌

（1.河北省疾病预防控制中心艾滋病防治所，河北 石家庄 050021；2.河北省邱县中心医院，河北 邯郸 057450）

1981年，美国报道了全球首例获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）病例[1]。40年来，人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）广泛传播，已成为全球性的重大公共卫生问题。截至2020年年底，全球有3 770万例HIV感染/AIDS患者[2]。HIV主要分为HIV-1和HIV-2这2种类型，HIV-1是造成全球大流行的主要病原毒株，具有极强的复制、变异和重组能力，遗传性复杂、多样，是AIDS防治和疫苗研制的主要障碍[3]。本研究对河北省3例经男男同性性接触感染HIV-1的男男同性恋（men who have sex with men，MSM）病例的血浆样本进行HIV-1近似全长基因组序列（near full-length genome，NFLG）分析，确定其重组模式，为研究HIV-1遗传多样性提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 研究对象

3例患者（编号分别为150、110和171）均为MSM，2019年于河北省艾滋病确证中心实验室确证为HIV-1抗体阳性，均通过不安全的同性性行为感染HIV-1。3人均已婚或同居，年龄分别为43、52和41岁，血液中HIV-1含量分别为5.45×105、3.02×105和2.54×104拷贝/mL，CD4细胞数分别为263、479和135个/μL。所有病例暴露前均未服用暴露前预防用药，未进行过抗HIV-1治疗。在对这3例病例进行耐药基因型检测时，初步分析其基因亚型分别为B/C、B/C和01_AE/B。本研究经河北省疾病预防控制中心伦理委员会审核通过[IRB（S）-2020-002]。

1.2 方法

1.2.1 HIV-1 RNA提取和目的基因组扩增

采集患者静脉血样本，离心分离血浆，-80 ℃保存待检。参照德国Qiagen公司QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书，从140 μL血浆样本中提取HIV-1 RNA。采用日本TaKaRa公司Prime Script One Step RT-PCR Kit和LA Taq，参照张菲等[4]的方法设计引物进行NFLG（HXB2：649-9599）扩增，扩增产物送北京博迈德基因测序公司进行测序。

1.2.2 序列拼接比对和系统发育分析

用CExpress 9.1软件将每个患者样本的所有原始反应序列拼接成1条完整的NFLG，使用HIVAlign在线软件进行基因序列比对（https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/VIRALIGN/viralign.html），然后通过BioEdit 7.0软件进行手动编辑和校对。采用MEGA 7.0软件，基于邻近法和Kimura 2-parameter model构建neighborjoining进化树，以Bootstrap值≥70%为有意义。不同亚型参考株（A-D、H-K、O、CRF）的NFLG下载自HIV Databases数据库（https：//www.hiv.lanl.gov/）。

1.2.3 NFLG基因组镶嵌结构分析

首先用HIV Databases数据库中的jpHMM在线软件初步分析3条NFLG的基因重组图谱。然后用SimPlot v3.5.1软件进一步分析NFLG与参考序列的相似性和重组模式，确认NFLG的镶嵌结构和基因重组断点。

2 结果

2.1 系统发育树分析结果

经过核酸提取、扩增和序列测定，获得3条HIV-1 NFLG（GenBank序列编码：ON959789-ON959791）。NFLG 150、NFLG 110和NFLG 171长度分别为8 966、8 740和8 994 bp。基于这3条NFLG与参考序列构建neighbor-joining进化树，在进化树上，病例110、150和171的NFLG与其他各参考亚型序列距离较远，分别形成了单独的分支，其中110和150与CRF07_BC具有共同的根，见图1。说明这3例患者的NFLG可能是新型重组毒株，需要通过基因重组断点分析进行确认。

图1 基于NFLG的neighbor-joining进化树

2.2 NFLG jpHMM在线软件分析结果

基于HXB2参考株的基因位点，发现与参考株CRF07_BC的基因组图谱相比，病例110和150的jpHMM基因组图谱右边的env区基因重组断点基本一致，但是在gag-pol区存在差异，病例150的jpHMM基因组图谱分别在gag区1 270～1 411位点和pol的3 011～3 311位点缺少2个C和B的基因重组断点，初步判定其可能为有C亚型和B亚型参与重组的新型重组毒株。病例110的jpHMM基因组图谱在gag区1 270～1 411位点没有重组断点，并且在pol区的3 108±119位点有基因缺失，说明该病例存在多种亚型毒株重组的可能。jpHMM基因组图谱显示病例171的NFLG与CRF01_AE一致。见图2。

图2 近似全长基因组的jpHMM重组分析

2.3 近似全长基因组基因相似性分析

采用SimPlot v3.5.1软件对这3条NFLG和不同亚型的标准参考毒株进行基因相似性分析，并确定基因重组断点位置。结果显示，NFLG 150是由CRF01_AE和CRF07_BC这2个循环重组形成的新型二代重组毒株，该序列的基因重组模式是2个CRF01_AE亚型片段分别插入到CRF07_BC亚型基因组骨架中，在BootScan图谱上，插入重组位点1个在gag区的740～800位点，另1个在env区的8 320～8 400位点，见图3。然而，由于插入的2个CRF01_AE片段均较短，分别约为60和80 bp，如果进行基因亚区进化树分析难度较大，极有可能会与CRF07_BC参考序列集聚成簇，因此本研究未对其进行基因亚区进化分析。病例110和171的NFLG BootScan分析图谱显示，这2条NFLG分别为CRF07_BC亚型和CRF01_AE亚型，不是新型重组毒株，见图4。

图3 病例150的NFLG BootScan分析图谱

图4 病例110和171的NFLG BootScan分析图谱

3 讨论

斯坦福大学HIV公共数据库（https：//www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/ search/search.html）显示，目前全球已有118种CRF和大量的独特型重组毒株（unique recombinant form，URF）被发现。我国国家分子流行病学调查结果显示，随着传播途径的转变，CRF和URF数量快速增多，HIV-1亚型毒株的分布也发生了明显变化[5]。当前，性传播已成为我国HIV最主要的传播途径，CRF07_BC和CRF01_AE是我国最主要的流行毒株[6]，它们的共流行和双重感染为二代重组创造了条件。在上世纪90年代，CRF01_AE由泰国通过异性性传播传入我国，最早在我国云南、广西等地区异性传播人群和吸毒人群中流行[7-8]。CRF07_BC是在我国云南地区吸毒人群中发现的重组毒株[9]，后来随毒品网络传至四川、新疆等地区。随着传播途径由血液传播、注射吸毒传播向性接触传播转变，CRF01_AE和CRF07_BC快速向其他人群蔓延，特别是MSM人群。

2005年之前，河北省HIV-1主要以血液传播为主，B亚型是最主要的流行毒株[10]，随着传播方式向性传播，特别是MSM传播转变，2005年以后，CRF01_AE逐渐成为河北省最主要的流行毒株，B亚型居第2位[11]。相关研究结果表明，随着CRF01_AE的广泛传播，其在我国已经形成7个流行传播簇[12]。CRF07_BC的传播主要经历了2个指数增长阶段[9]，分别由07BC_O和07BC_N驱动。07BC_O是原始CRF07_BC传播簇，在注射吸毒者和异性恋人群中传播，主要分布在我国西南和西北地区；07BC_N是一个新的群体，主要在我国北方的MSM中发现，随着时间的推移呈递增趋势，逐渐取代了07BC_O。与广西、云南等地区流行的经异性性接触感染和吸毒人群流行簇不同，河北省CRF01_AE传播簇主要以MSM流行传播簇为主[11]，CRF07_BC的主要传播簇是07BC_N。特别是这些流行簇与北京、辽宁等相邻地区的MSM人群紧密相关，聚集成簇[13]，具有较大的传播风险。

有研究发现，一个地区同时流行多种毒株是造成双重感染、多重感染和新型基因重组的主要原因，如广西地区的CRF01_AE/CRF07_BC/CRF08_BC三重重组[14]，贵州、辽宁地区的CRF01_AE/CRF07_BC双重重组[15-16]。CRF01_AE和B亚型作为主要流行毒株，经过在河北省省内长时间的流行，已经形成大量具有不同镶嵌结构的新型CRF01_AE/B重组体[11]，有的已广泛流行，转化成为CRF，如发现于保定地区的CRF103_01B毒株[17]。然而，CRF01_AE/CRF07_BC二代重组鲜有报道。从2021年开始，连续在MSM人群中发现2个具有不同重组断点的CRF01_AE/CRF07_BC重组体[18-19]，提示随着CRF07_BC在河北省新报告病例中所占比例上升到第2位，有其参与重组的重组毒株将会越来越多。

本研究确定了以CRF07_BC 为骨架的CRF01_AE/CRF07_BC重组毒株，重组断点显示，2个小的CRF07_BC基因片段分别在gag区和env区插入到CRF07_BC基因组骨架中，明显不同于2021年报道的二代重组模式[18-19]，再次确认了河北省HIV-1遗传基因的多样性和流行情况的严峻。另外，河北省发现的CRF01_AE/CRF07_BC二代重组毒株均来自MSM人群，我国已在MSM人群中发现6种CRF[17]。目前，河北省HIV传播仍处于上升期，报告AIDS病例以青壮年为主，性活动活跃，近10年来性传播持续成为主要传播途径，占96.9%，其中MSM者占64.2%[20]。在河北省已发现的HIV-1亚型均已在MSM人群中流行，并且CRF01_AE和CRF07_BC已分别在以MSM为主的性传播人群中形成6个和1个大传播簇，与邻省形成紧密传播关系[11，13]，这为新型重组毒株的形成和传播创造了条件。自2013年CRF07_BC超越B亚型成为河北省第2位流行毒株以来，河北省关于HIV-1全基因组重组结构的研究缺失，提示应加强对性传播，特别是MSM人群HIV-1基因多样性和传播特征的研究，及时掌握河北省基因重组毒株流行情况，干预该人群传播簇的形成，阻止其向外传播和形成新的CRF。