UFLC法测定不同地区博落回果实中生物碱的含量

郑梅霞，苏海兰，李炽勤，朱育菁，陈 宏，牛雨晴，朱雁鸣

[福建省农业科学院作物研究所(福建省种质资源中心), 福建 福州 350013]

博落回为罂粟科博落回属植物Macleayacordata(Willd)R.Br.，在我国分布广泛，因产地不同，异名也多，如勃勒回、号筒杆和三钱三等20多种。博落回的主要活性成分为异喹啉类生物碱，包括原阿片碱(protopine，PRO)、别隐品碱(allocryptopine，ALL)、血根碱(sanguinarine，SA)以及白屈菜红碱(chelerythrine，CHE)等[1]。现代药理研究表明，博落回具有抗菌、抗肿瘤、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、杀灭钉螺、杀灭血吸虫和改善肝功能等活性[2-7]，广泛应用于药品、生物农药和兽药中[8]。

生物碱含量作为评价博落回质量的重要指标之一。目前，博落回生物碱提取工艺的研究主要集中在果实、叶、根部位。曾建国等[9]采用HPLC法测定了博落回果实中血根碱和白屈菜红碱的含量；苏海兰等[10]采用HPLC法研究了野生与种植博落回各部位生物碱含量；黄敬等[11]采用HPLC法对博落回不同部位原阿片碱、别隐品碱的含量进行了测定；李光伟等[12]采用超声波辅助优化了博落回根原阿片碱、别隐品碱提取工艺。研究表明，博落回中主要含有原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱4种生物碱，故本研究将其作为评价博落回果实质量的指标。但在不同的生长环境下，博落回生物碱类物质的含量也有不同程度的变化。本研究通过测定不同地区博落回果实中原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的含量，对不同地区的博落回果实生物碱含量进行差异分析，以期为博落回资源的筛选和选育提供参考，为当地选育优良博落回品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生博落回果实于2019-2021年间采集自15个地区16份资源材料，来源信息及编号见表1，将博落回果实粉碎过筛(50目)，密封保存备用。

表1 野生博落回果实来源信息

1.2 仪器与试剂

1.2.1试验仪器 FW135中草药粉碎机购自天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-200VDE双频数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；SP214分析天平购自奥豪斯仪器(上海)有限公司；SIL-20A Prominence UFLC快速液相色谱仪LC(UFLC)购自SHIMADZU。

1.2.2主要试剂 乙腈(色谱纯)购自默克股份两合公司；甲醇(色谱纯)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸(分析纯)购自西陇科学股份有限公司；标准品血根碱(SA)、白屈菜红碱(CHE)、原阿片碱(PRO)(纯度≥98%)购自上海源叶生物有限公司；标准品别隐品碱(ALL)(纯度≥98%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1博落回生物碱的提取 采用超声-甲醇提取法(ultrasonic assisted methanol extraction，UAME)：分别精确称取博落回果实粉末0.5 g至50 mL具塞比色管中，加入50 mL50%甲醇(含1%盐酸)，密封后于35℃超声60 min，超声功率180 W，取出放冷至室温，离心，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，获得检测样品，备用。

1.3.2标准品溶液的配制 (1)原阿片碱和别隐品碱的标准溶液：分别精确称取0.0017 g原阿片碱、别隐品碱于10 mL容量瓶中，加少量50%甲醇(含1%盐酸)溶液溶解，用50%甲醇(含1%盐酸)定容至刻度，配成质量浓度为0.17 mg·mL-1的原阿片碱和别隐品碱的标准溶液，4℃冷藏保存。(2)血根碱和白屈菜红碱的标准溶液：分别精确称取0.0025 g血根碱、白屈菜红碱于10 mL容量瓶中，加少量50%甲醇(含1%盐酸)溶液溶解，用50%甲醇(含1%盐酸)定容至刻度，配成质量浓度为0.25 mg·mL-1的血根碱和白屈菜红碱的标准溶液，4℃冷藏保存。(3)混合标准品：精密量取200 μL原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的标准品溶液混合均匀，分别取250、125、80、65 μL，加50%甲醇(含1%盐酸)250、375、420、455 μL分别稀释2、4、6、8倍，获得系列梯度浓度混合标准品溶液见表2。

表2 系列梯度混合标准品中原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的浓度

1.3.3 色谱条件

采用InertSustainSwiftTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相为0.1%磷酸乙腈(A)和0.1%磷酸水(B)(28∶72)；流速为：1.0 mL·min-1；进样量：5 μL；检测波长为284 nm，室温进样。供试品重复测试3次，以峰面积(Y)为纵坐标，样品浓度(mg·mL-1)为横坐标，进行线性回归处理，获得了原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的回归方程，依据标准曲线计算样品中4种生物碱的含量，以及这4种生物碱的总含量。

1.3.4数据统计和分析 采用SPSS 26.0软件对数据进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 博落回果实中生物碱测定方法的建立

混合标准品和博落回样品生物碱检测的UFLC色谱图见图1，可知采用本试验的测试方法可以同时检测出原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱4种生物碱。

注：PRO：原阿片碱；ALL：别隐品碱；SA：血根碱；CHE：白屈菜红碱图1 混合标准品(A)及博落回样品(B)UFLC色谱图Fig.1 UFLC chromatograms of the mixed standard substance (A)and Macleaya cordata sample (B)

2.2 不同地区博落回果实中总生物碱含量差异比较

不同地区博落回果实中4种生物碱的总含量见表3，总生物碱含量范围为(0.0066±0.0008)%～(0.4352±0.0082)%，其中，MC-1的总生物碱含量最高，达(0.4352±0.0088)%，与其他地区的样本具有显著性差异，MC-3、MC-4次之，分别为(0.3406±0.0076)%和(0.3281±0.0021)%。MC-16最低，仅含有(0.0066±0.0008)%。

表3 不同地区博落回果实中原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱的含量

2.3 不同地区博落回果实中4个生物碱含量比较

15个地区博落回果实的原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱含量范围分别为(0.0019±0.0004)%～(0.1244±0.0020)%、(0.0015±0.0001)%～(0.1480±0.0053)%、(0.0019±0.0003)%～(0.1187±0.0015)%、(0.0010±0.0007)%～(0.0530±0.0002)%。果实中原阿片碱含量最高的是MC-3(0.1244±0.0020)%，最低是MC-16(0.0019±0.0004)%；别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱含量最高的均是MC-1，分别为(0.1480±0.0053)%、(0.1187±0.0015)%、(0.0530±0.0002)%，最低的均为MC-16，分别为(0.0018±0.0005)%、(0.0019±0.0003)%、(0.0010±0.0007)%。MC-1的4种生物碱含量由高到低的趋势为别隐品碱>血根碱>原阿片碱>白屈菜红碱。

综上所述，福建省三明市明溪县的MC-1博落回果实中别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱含量及4种生物碱总含量在15个地区样本中均最高，具有较好的博落回种质资源开发的潜力，可促进博落回优良品种的选育。

3 结论与讨论

本研究分析了15个不同地区的16份博落回资源果实中原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱及这4种生物碱的总含量，其中福建省三明市明溪县的MC-1博落回果实中的别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱及4种生物碱总含量均最高，分别为(0.1480±0.0053)%、(0.1187±0.0015)%、(0.0530±0.0002)%、(0.4352±0.0088)%，说明福建省三明市明溪县的地理环境比较适合博落回资源的生物碱的累积。不同的生态环境对博落回生物碱的含量影响很大，邹惠亮等[13]研究表明安徽绩溪的庄年村、梅干岭、杨村阳山、石岑村和下屋村的博落回果实中血根碱和白屈菜红碱含量存在差异；王曙光等[14]对宁国、铜陵、宣城、广德和桐城等不同地区博落回果实的白屈菜红碱和血根碱的含量进行比较表明广德地区的最高，表明博落回栽培时的生态环境对博落回资源的开发利用至关重要。

福建省三明市明溪县MC-1可作为种质筛选的优良资源，其原阿片碱、别隐品碱、血根碱和白屈菜红碱4种生物碱中，含量高低为别隐品碱>血根碱>原阿片碱>白屈菜红碱，别隐品碱的含量最高；与苏海兰等[10]研究表明博落回中别隐品碱、原阿片碱、血根碱和白屈菜红碱4种生物碱中别隐品碱含量最高的研究结果一致；而黄敬等[11]和刘秀斌等[15]研究表明博落回果实中原阿片碱含量最高；钟明等[16]研究表明博落回果荚中血根碱含量最高。说明不同地区和不同部位的博落回中的生物碱种类与含量变化规律还有待进一步探索。