枇杷酵素发酵过程生物学特性和主要功效酶活性研究

陈洲琴，张祝兰*，程 贤，林仙菊，杨煌建，严雪浪，朱爱明，连云阳*

[1.福建省微生物研究所/福建省新药(微生物)筛选重点实验室, 福建 福州 350007;2.仙游县清风生态农庄有限公司, 福建 莆田 351200]

枇杷是福建省莆田市四大名果之一，果实营养丰富，味道鲜美，具有清热、润肺等作用，具有较高的营养和食用价值。枇杷成熟期集中在初夏高温、多湿季节，应季产量大，但保质期短、易腐烂变质，不利于贮藏和长途运输[1-3]，因此枇杷短时集中上市和滞销问题备受关注。目前枇杷果实除鲜食外，相关的加工产品主要有枇杷汁、枇杷罐头、枇杷果酱及枇杷酒等[4-6]。近年来，随着发酵产品的发展，水果酵素也逐渐走进了人们的生活[7-9]，将枇杷发酵成枇杷酵素产品也是解决枇杷产品销售困难的一个重要手段。对于水果酵素的研究大多集中在发酵工艺的优化、生物活性的探究及代谢物质的分析等研究[10-16]，目前对于枇杷酵素的报道较少，有对其抗氧化活性功能开展研究[17]，但对于枇杷酵素自然发酵过程中微生物群落、氨基酸等代谢产物和主要功效酶等变化规律的全面评价，以及其发酵过程的监控研究尚未系统开展。

本研究以枇杷为原料，探究发酵时间对枇杷酵素生物学特性及主要功效酶活的影响，为构建枇杷酵素的综合评价体系以及枇杷的高价值化利用和精深加工提供参考，为促进当地特色水果加工及副产物产业链发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枇杷由仙游清风生态农庄有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1试验仪器 LC-2030高效液相色谱仪：日本岛津公司；Allegra X-15R离心机：德国Beckman公司；752紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；L-8900型氨基酸分析仪：日本日立公司；DKZ-2B 型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；S20K酸度计：梅特勒-托利多公司。

1.2.2主要试剂 红糖(食品级)：广西马山南华糖业有限责任公司；YPD培养基和MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；乳酸、乳酸钠、β-葡聚糖、无水碳酸钠、乙酸、乙酸钠、三氯乙酸、无水乙醇、氢氧化钠等(均为分析纯)：天津凯通化学试剂有限公司；DNS试剂、SOD酶活性试剂盒、脂肪酶活性试剂盒、福林酚溶液、酚酞：生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇(色谱纯)、磷酸(色谱纯)、柠檬酸钠(色谱纯)、氢氧化钠(色谱纯)、盐酸(色谱纯)、酪蛋白和L-酪氨酸标准品：默克密理博公司；17种氨基酸标准品：中国食品药品检定研究院；没食子酸、葡萄糖、乳酸标准品：上海源叶生物科技有限公司。

1.3 枇杷酵素的制备无菌水清洗枇杷2～3次，于洁净处晾干，切片、去除核，按枇杷∶糖∶无菌水为1∶3∶10(质量比)配制，28℃左右自然发酵，发酵时间140 d。定期取样，将样品离心后的上清液保存于-80℃超低温冰箱中待测。

1.4 指标测定

1.4.1有效活菌数的测定 取发酵1、5、20、35、50、65、80、95、110、125和140 d的样品测定有效活菌数。采用平板菌落计数法，分别用YPD培养基和MRS培养基对发酵液进行选择培养，测定酵母菌和细菌菌落数。菌落计数方法测定参照GB4789.2-2016《食品微生物菌落总数的测定》。

1.4.2pH值和总酸的测定 取发酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的样品测定pH值和总酸。使用精密pH计测定酵素样品的pH值；总酸含量的测定方法参照GB12456-2021《食品中总酸的测定》。

1.4.3有机酸含量的测定 取发酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的样品测定有机酸含量。测试液以去离子水稀释10倍后，0.22 μm微孔滤膜过滤后用HPLC测定酵素中的有机酸含量。色谱条件：色谱柱为Kromasil100-5-C18(4.6 mm×250 mm)，流动相为0.1%磷酸溶液-甲醇(97.5%～2.5%)比例的流动相，流速0.6 mL·min-1，柱温40℃，进样量20 μL，检测波长210 nm；结果以乳酸质量浓度g·L-1计。

1.4.4总酚含量的测定 总酚含量测定参照GB/T 31740.2-2015《茶制品第2部分：茶多酚》。标准曲线绘制：蒸馏水配制0.1 mg·mL-1的没食子酸标准溶液；精确量取系列没食子酸标准溶液(0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 mL)，分别加入10%福林-酚试剂1 mL及7.5%的Na2CO3溶液2 mL，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，室温下避光反应1 h后，在765 nm波长下测定OD值，以测定的OD765值为横坐标，没食子酸各溶液的浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

取发酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的样品测总酚含量，测试液以去离子水稀释10倍后，量取样品0.25 mL，加入福林酚试剂1 mL及7.5% Na2CO3溶液2 mL，蒸馏水定容至10 mL，摇匀，室温下避光反应1 h，测定的OD765值，参照标准曲线定量样品中总多酚含量。

1.4.5氨基酸含量的测定 取发酵35、80和140 d的发酵液测定氨基酸含量。氨基酸含量的测定方法参照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》。

1.4.6主要功效酶活力测定 取发酵1、5、20、35、50、65、80、110、125和140 d的发酵液测定主要功效酶活力。蛋白酶活力测定参照CB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定 分光光度法》；脂肪酶活力测定参照脂肪酶试剂盒的操作说明；β-葡聚糖酶测定参照NY/T 911-2020《饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定 分光光度法》；SOD酶活力测定参照SOD酶试剂盒的操作说明。

2 结果与分析

2.1 有效活菌数

由表1可知，枇杷酵素的有效活菌数在发酵过程中呈现不断上升趋势，在发酵5 d后，有效活菌数快速上升达到109数量级，发酵140 d有效活菌数保持在108数量级上，说明枇杷酵素菌群生长状态良好，具有稳定的微生物生态环境。

表1 枇杷酵素发酵过程中有效活菌数的变化

2.2 pH值与总酸

由图1可知，随着发酵进程，pH值在20 d内由4.8下降至3.5，后期一直稳定于3.5左右；总酸总体呈现出不断上升的趋势，总酸在125 d达到最大值12.5 g·L-1，发酵至140 d后总酸含量有所下降。

图1 枇杷酵素发酵过程中pH、总酸含量的变化Fig.1 Changes of pH and total acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.3 有机酸含量

由图2可知，枇杷酵素的有机酸含量在1～20 d呈快速上升趋势，有机酸含量增加至6.26 g·L-1，20～140 d有机酸含量趋于稳定。

图2 枇杷酵素发酵过程中有机酸含量的变化Fig.2 Changes of the organic acid content in the fermentation process of loquat ferments

2.4 总酚含量

总酚测定的标准曲线见图3。标准曲线方程为y=0.0049x+0.1025，R2=0.9978线性关系良好。枇杷酵素发酵过程中总酚含量呈现先增后降趋势，在65 d总酚含量达到0.9 mg· mL-1，到65～140 d后呈下降趋势。

图3 总酚测定的标准曲线Fig.3 Standard curve for the determination of total phenols

图4 枇杷酵素发酵过程中总酚变化Fig.4 Changes of total phenols in the fermentation process of loquat ferments

2.5 氨基酸含量

由表2可知，枇杷酵素含有17种氨基酸，其中含量较高的氨基酸分别为天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸。随着发酵时间增加，各氨基酸含量在不同阶段出现波动变化，总氨基酸含量与必需氨基酸含量逐渐提高，说明一定时间的发酵能提高酵素中蛋白质和氨基酸的含量，且提高程度较明显。

表2 枇杷酵素发酵过程中氨基酸含量的测定结果

2.6 主要功效酶的酶活力

由图5可知，枇杷酵素自然发酵过程中不同功效酶酶活力出现波动性变化，其中蛋白酶活力在1～35 d呈逐渐上升趋势，在发酵35 d时其酶活力最高达15.14 U·mL-1，在发酵35 ～65 d呈现缓慢下降趋势，65～140 d酸性蛋白酶活性趋于稳定；SOD酶活力在1～65 d阶段呈上升趋势，在发酵65 d时其酶活力最高达42.0 U·mL-1，在发酵65～140 d呈现缓慢下降趋势；β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趋势，在发酵20 d时其酶活力最高达4.52 U·mL-1，在发酵20～140 d β-葡聚糖酶活性趋于稳定；脂肪酶活力在1～5 d呈现较较快的上升趋势，并在5 d取得最大值0.12 U·mL-1，然而随着发酵时间延长，发酵液中脂肪酶活性逐渐降低。

图5 枇杷酵素发酵过中主要功效酶的变化Fig.5 Changes of the main efficacy enzymes in the fermentation process of loquat ferments

3 结论与讨论

本研究对枇杷酵素发酵过程中生物学特性指标(有效活菌数、pH值、总酸、总酚、氨基酸)及功效酶活性(SOD、蛋白酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶)进行动态分析。结果发现，随着发酵进程，发酵液中有效活菌数保持在108数量级上，有效维持稳定的微生物生态环境，这对发酵过程中代谢产物的变化有着重要影响作用。发酵液的 pH 值先降低后维持稳定在3.5，而总酸含量不断增加至6.26 g·L-1后趋于稳定，发酵前期总酸含量的快速上升是由于自然发酵过程乳酸菌大量繁殖、代谢活跃，利用发酵液的糖作为碳源发酵产生乙酸、乳酸等有机酸，致使发酵液总酸含量增加、pH值降低[18]。而发酵后期体系中有机酸种类及含量的增加，可抑制部分有害菌生长，pH 值和总酸含量变化均趋于平缓，推测是因为发酵后期营养物质基本被消耗殆尽，微生物代谢缓慢，仅将有机酸等替代碳源维持生命活动，故总酸含量降低[16]。总酚含量在0～65 d呈现上升趋势，到65～140 d后出缓慢下降趋势。主要发挥抗氧化性能的物质是多酚类，大分子物质可以在微生物的发酵作用下，转变成小分子酚类。枇杷酵素含有17种氨基酸，含量较高的氨基酸主要是天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸。随着发酵时间增加，各氨基酸含量在不同阶段出现化，总氨基酸含量与必需氨基酸含量逐渐提高，说明一定时间的发酵能提高酵素中蛋白质和氨基酸的含量，且提高程度较明显。氨基酸是人体不可或缺的重要物质之一，不仅可以为身体提供能量还可以提高免疫力，具有很高的生物活性[19]。枇杷酵素中不同功效酶的活性变化规律不同，酸性蛋白酶活力在1～35 d呈逐渐上升趋势，在发酵35 d时其最高酶活力至15.14 U·mL-1，在发酵35 ～65 d呈现缓慢下降趋势，65～140 d酸性蛋白酶活性趋于稳定。SOD酶活力在1～65 d阶段呈上升趋势，在发酵65 d时其酶活力最高达42.0 U·mL-1，在发酵65～140 d呈现缓慢下降趋势。脂肪酶在1～5 d呈现较较快的上升趋势，发酵5 d达到最大值为0.12 U·mL-1，随着发酵时间延长发酵液中脂肪酶活性逐渐降低。脂肪酶活力较低，这可能与枇杷中脂肪含量较少有关，该结果与报道的水果酵素等一致[20]，由于酵素初期微生物迅速增长，使得体系pH下降至3.5，整体呈酸性，而脂肪酶的最适pH 在中性或碱性范围内，也可能是发酵过程中其活性较低的原因之一。β-葡聚糖酶活性在1～20 d呈上升趋势，在发酵20 d时其酶活力最高达4.52 U·mL-1，在发酵20 ～140 d β-葡聚糖酶活性趋于稳定。

枇杷酵素含有多种的功效酶，其中β-葡聚糖酶是一类重要的水解酶，具有抑菌作用且对对植物抗病防御体系中起着重要作用[21-24]。枇杷酵素中含有丰富的β-葡聚糖酶，使用酵素代替部分农药为解决使用化学农药残留的问题提供一个新思路。酵素在建立绿色生态农业，提高农产品质量，以及农业可持续发展中有着广阔的应用前景，进一步研究酵素中β-葡聚糖酶的功效作用以及开发种类更多、酶活力更高、稳定性和适用性更好的酵素酶具有重要意义。