一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术

林 旻，杨绍华，林 艳，王 月，胡太蛟，宋亚娜，潘雷博，陈在杰*

(1.福建省农业科学院生物技术研究所/福建省农业遗传工程重点实验室,福建 福州 350003; 2.福建农林大学生命科学学院, 福建 福州 350002)

得益于生物信息学、基因组学、表型组学、芯片技术等发展，水稻迎来了智能育种4.0时代。对育种家来说，数字技术的应用可显著提升作物新品种的选育效率。近年来，基于高通量测序及DNA芯片技术的第三代SNP(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分子标记辅助选择技术蓬勃发展，包括：基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)、TaqMan、半热不对称逆向PCR(Semi-Thermal Asymmetric Reverse PCR，STARP)等类型的分子标记检测技术。其中，STARP标记由于其低成本、高通量、多平台兼容性好的特点，目前已在水稻[1]、小麦[2]等作物中大量应用，是基因型鉴定的重要手段。分子标记辅助选择技术的检测对象是大批量遗传分离群体，所以高通量、低成本、高质量的DNA提取方法是关键，直接影响分子标记筛选效率。

目前，水稻分子检测的DNA来源多为叶片。常规的DNA提取方法中TPS法[3]可满足快速、高通量提取水稻叶片中的DNA。大规模群体筛选时，采取水稻叶片需要单株单叶标记，操作烦琐、容易出错；受水稻生长阶段的限制，获得分子检测结果后，再结合表型开展后续筛选，费时费事费地。而“先筛后种”可以大大提高育种规模与基因资源的挖掘利用效率，同时加快育种进程。从水稻种子中提取DNA用于分析，在育苗前完成鉴定，可以有效解决上述问题，但水稻种子中80%的成分都是淀粉，采用TPS法无法快速提出高质量的DNA。因此，急需开发一种适用于高通量基因分型的高质量水稻切片种子DNA提取制备技术。

利用磁珠法[4]中超顺磁性纳米粒子在一定环境下与核酸结合，通过淀粉酶解与4轮洗涤步骤可以去除水稻种子中大量的淀粉、蛋白质、脂类等物质。鉴于该法以上特点，本研究提出96孔板结合磁珠法，采用自动化核酸提取工作站提取水稻种子切片DNA，通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度，进一步采用STARP标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量，以期获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程，可为大规模水稻样品检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自福建省农业遗传工程重点实验室收集保存且已完成基因组测序样品：长粒香、特青、粤农丝苗、水源377、TN05、野丰占、金优1号等119份优质种质资源。

1.2 仪器和试剂

1.2.1样品前处理与核酸提取设备 自动种子切片机(北京金标记生物科技有限公司 CGMB-20R)、超高通量组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司JXFSTPRP-576)、台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司H2100R)、8道自动移液工作站(苏州中析仪器有限公司SC9300)、全自动核酸提取仪(杭州奥盛仪器有限公司Auto-Pure 96)、超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司Nano-500)。

1.2.2高通量基因分型设备 高通量基因分型系统(成都翰辰光翼科技有限责任公司GeneMatrix)由反应板制备仪MatrixArrayer、高通量水浴热循环仪MatrixCycler与高速荧光扫描仪MatrixScanner三台设备及HC-master基因分型数据处理软件组成。

1.2.3主要试剂 TPS缓冲液：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA(pH 8.0)、7.45 g KCl，用纯水定容至100 mL；裂解液Ⅰ：10 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 mL 1 mol·L-1NaCl、2 mL 0.5 mol·L-1EDTA、5 g SDS，用纯水定容至100 mL；酶处理液：中温α-淀粉酶水溶液；裂解液Ⅱ：70.92 g异硫氰酸胍、7.5 mL 1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、3 g月桂酰基氨酸、6 mL 0.5 mol·L-1EDTA，用纯水定容至100 mL；TE缓冲液：0.12114 g Tris、200 μL 1 mmol·L-1EDTA，用纯水定容至100 mL。

1.3 试验方法

1.3.1TPS法和96孔板结合磁珠法提取水稻DNA步骤

TPS法。(1)15 mg叶片研磨成粉，加入TPS提取液300 μL；(2)70℃水浴45 min，其间每隔10 min上下颠倒摇匀1次；(3)放置室温后4000 r·min-1离心15 min，取上清至新的深孔板；(4)加入无水乙醇(上清∶无水乙醇=1∶2.5)，-20℃冰箱冰冻30 min以上；(5)4000 r·min-1离心15 min，弃上清，加入75%乙醇300 μL，振荡悬浮液，4000 r·min-1离心15 min，弃上清，待干燥后加入100 μL TE缓冲液，即获得DNA溶液。

96孔板结合磁珠法。(1)将水稻种子脱壳得到糙米，使用自动种子切片机或手工将糙米对等切分成两半，不带胚的切片放入96深孔板供DNA提取使用，含胚切片放入96孔育苗盘留作发芽成苗；(2)将含有不带胚切片研磨成匀浆后的96深孔板(B1)置于8道自动移液工作站，向每个样本加入120 μL裂解液Ⅰ，温控振荡仪65℃、800 r·min-1裂解15 min；(3)使用8道自动移液工作站向B1中加入10 μL酶处理液，70℃消化15 min；(4)将B1使用4000 r·min-1转速离心15 min后，使用全自动移液工作站吸取上清到新的96孔提取板(B2)，将B2使用全自动移液工作站加入180 μL裂解液Ⅱ后，置于温控振荡仪65℃、800 r·min-1裂解15 min；(5)使用8道自动移液工作站向B2依次加入480 μL异丙醇、40 μL磁珠、200 μL TE缓冲液，获得DNA混合液；(6)放入全自动核酸提取仪，配置程序，按如下板位放置96深孔板进行DNA提取，板位1：磁棒套；板位2：DNA混合液；板位3：每孔400 μL异丙醇；板位4：每孔400 μL80%乙醇；板位5：每孔400 μL异丙醇；板位6：每孔400 μL80%乙醇；板位8：每孔200 μLTE缓冲液，板位8获得的就是纯化后的样品DNA溶液。

1.3.2提取水稻叶片和切片种子DNA质量和浓度测定 随机选取32个不同品种水稻，分别用TPS法提取水稻苗期叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA。每个品种的两种方法各提取3个重复。核酸的浓度和纯度通过ODA260、ODA280和ODA230值分析[5]，ODA260/A230的比值用于评价DNA多糖、盐离子等杂质的污染程度；ODA260/A280的比值用于评价蛋白质、RNA等杂质的污染程度。理想状态ODA260/A230的比值应大于2.00，ODA260/A280的比值低于1.60表明含有蛋白质等杂质污染，高于2.00表明含有RNA等杂质污染。

吸取1～2 μLDNA原液，使用超微量分光光度计分别测定TPS法、96孔板结合磁珠法提取的DNA样品浓度和纯度(在230、260和280 nm波长处的吸光值)，每个方法随机抽取检测8个品种(长粒香、特青、粤农丝苗、水源377、TN05、野丰占、金优1号和农香32)并使用0.5% DNA琼脂糖凝胶电泳检测样品核酸的完整度和质量(100 V、20 min)。

1.3.3STARP标记检测验证 利用STARP技术对两个水稻优异基因进行分子标记检测，以验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。本研究针对粒型基因GS3[6]、米质基因Wx[7]分别进行基因分型。PCR扩增体系参考Long等[1]，根据引物接头的不同，扩增产物中长粒型等位基因gs3为HEX信号，而短粒型等位基因GS3为FAM信号；高直链淀粉等位基因Wxa为FAM信号，低直链淀粉等位基因Wxb为HEX信号，STARP反应体系见表1所示。由高通量基因分型系统的Matrix Arrayer自动化构建获得384孔的PCR扩增板，之后放入水浴热循环仪Matrix Cycler中进行扩增。

表1 PCR反应体系

水浴PCR反应程序为，94℃ 3 min变性；第一阶段循环为94℃ 20 s，56℃退火延伸2 min，每个循环降低1℃，共6个循环，第2个阶段循环为94℃ 20 s，62℃退火延伸90 s，42个循环；最后62℃延伸2 min。在高速荧光扫描仪Matrix Scanner上读取荧光信号值，通过HC-master基因分型软件自动分析基因型。

2 结果与分析

2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果

由图1可知，经DNA琼脂糖凝胶电泳检测，96孔板结合磁珠法提取的DNA条带可以清晰、明亮的目的条带，而TPS法提取的DNA大多降解呈现弥散带。

注：a)为96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA；b)为TPS法提取水稻叶片DNA；1～8分别代表长粒香、特青、粤农丝苗、水源377、TN05、野丰占、金优1号和农香32。图1 DNA琼脂糖凝胶电泳Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis

2.2 核酸提取结果与分析

由表2可知，96孔板结合磁珠法提取DNA浓度为46～102 ng·μL-1，TPS法提取核酸浓度为49～81 ng·μL-1，二者没有明显的差别。但TPS法提取的叶片DNA溶液ODA260/A230在1.22～1.62，ODA260/A280在1.63～1.88，96孔板结合磁珠法提取的水稻切片种子DNA溶液ODA260/A230在1.60～1.90，ODA260/A280在1.73～1.90，每一组样品的均值均高于TPS法提取的叶片DNA溶液，说明TPS虽然快速简便但存在多糖等杂质，纯度低。以上结果表明96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片DNA的质量明显优于TPS法提取水稻叶片DNA的质量。

表2 不同提取方法的DNA浓度、质量

2.3 STARP标记检测验证结果

由图2a可知，GS3基因分型结果显示95份样品分为3种基因型，其中短粒型10份，长粒型66份，杂合型19份；由图2b可知，Wx基因分型结果显示94份样品分为2个不同类群(图2b)，其中低直链淀粉型79份，高直链淀粉型15份。由表3可见，两种优异功能基因分型结果和各品种已知测序基因型完全一致，表明使用本方法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型。

注：a)为GS3基因分型，长粒型等位基因为HEX信号(黄)，短粒型等位基因为FAM信号(红)，杂合型为绿；b)为Wx基因分型，低直链淀粉等位基因为HEX信号(黄)，高直链淀粉等位基因为FAM信号(红)图2 水稻种质资源GS3、Wx基因STARP标记分析Fig.2 STARP marker analysis of GS3 and Wx genes in rice germplasm resources

表3 水稻种质资源GS3、Wx基因型鉴定结果

2.4 96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型流程

应用自动种子切片机，8 h可完成4000粒水稻种子切片与自动分装；配合超高通量组织研磨仪、8道自动移液工作站及全自动核酸提取仪，采用96孔板结合磁珠法DNA提取方法，可实现高通量水稻切片种子样本核酸的自动化提取；结合高通量基因分型设备可实现每日数万个基因分型数据点的检测通量。高通量分型操作流程如图3所示。

图3 高通量基因分型流程示意图Fig.3 Schematic diagram of the high-throughput genotyping

3 讨论与结论

本研究两种方法提取的DNA溶液ODA260/A280的范围都在1.60～2.00，均可用于后续分子检测试验，但从DNA琼脂糖凝胶电泳的结果看，胶孔存在微弱条带说明都有存在少量蛋白质污染，出于成本与时间考虑，两种方法都没有添加去除蛋白质的试验步骤，而磁珠纳米粒子在吸附DNA同时有部分蛋白质也会裹挟在纳米粒子表面，但是不会对STARP标记结果产生影响。

目前水稻分子标记快速检测主要使用TPS法提取水稻叶片核酸，该方法虽然简单、快速，但是提取的核酸纯度较低，存在蛋白质及多糖的污染，完整性差、保存时间短，不利于多批次多位点的检测。本研究利用水稻切片种子作为DNA抽提材料，相比于从叶片提取DNA的方法，不受育苗场地与苗期的时间限制，可提高基因分型的灵活性与效率。本研究采用高通量种子切片机，基于96孔板提取水稻切片种子核酸，操作简单，省时高效，一人一天可以提取4000份以上的样品。

分子标记辅助育种技术使育种家可以根据地域、饮食偏好有针对性的选育聚合不同优异功能单倍型的水稻新品种。例如粒型不仅是外观品质性状，也是影响米质的关键基因，对提高水稻产量和品质至关重要[8]。粒型的改变甚至可以提高水稻产量和外观品质，培育出高产、优质的水稻品种。Liu等[9]通过聚合GS3、LGY3与直立密穗基因DEP1这3个基因的特定单倍型，提高水稻籽粒的长度、改善水稻籽粒的长宽比，达到同时改良水稻产量性状与品质性状的目的，在显著提升稻米品质的基础上还可使其产量增加7%以上。水稻直链淀粉是评价水稻蒸煮食味品质的重要指标之一，针对不同的用途其对直链淀粉的高低需求也不同。本研究96孔板结合磁珠法提取的核酸用STARP标记分型进行验证，对控制粒型基因GS3、直链淀粉含量基因Wx进行鉴定，其结果与各品种重测序基因型一致，说明本法提取出的核酸纯度高、可用于育种群体的高通量基因分型，也为大规模水稻样品检测提供技术支持。