早期龋变牙釉质的透射电镜能谱分析

朱国青

(浙江大学 浙江大学电子显微镜中心 材料科学与工程学院,浙江 杭州 310027)

龋,朽也,龋齿也常被国人叫做蛀牙或虫牙,其英文名为Dental caries(caries来自拉丁语decay),即牙齿的腐烂(Decay in teeth),异曲同工。如何预防和治疗龋齿,是人们生活水平提高后对健康甚至是精神层次的更高要求。已被广为接受的龋变过程是,因牙齿排列不整齐,比如牙齿之间缝隙比较大或有裂沟,亦或有重叠,牙齿有凹坑等,这些部位常有食物残渣滞留,而且不易被日常的刷牙、漱口操作去除,易于形成牙菌斑堆积而紧贴牙釉质,食物残留在唾液环境中被细菌分解产生酸,牙釉质脱矿成龋,也就是酸源(化学寄生)学说[1]。比如考古学家就发现古代非洲农人主要食用不含糖的谷物粥和酸奶,而他们的牙齿磨耗很轻但龋齿较严重,认为这可能是因为粥米黏附在他们的牙齿之间不能得到及时有效的清理,使之成为细菌滋生的温床[2]。另外也有一些其他理论,如蛋白溶解理论和蛋白溶解-螯合理论。而牙结石是矿化了的牙菌斑和细胞碎片,其矿物质来源于唾液中所含的钙、磷等矿物盐[3]。因龋变多是从牙齿表面(牙釉质,俗称珐琅质)开始被观察到,所以作者试从健康牙釉质、龋变牙釉质和牙结石的成分进行研究牙齿龋变过程。

能谱作为材料成分分析常用工具,原理是电子束和样品作用,原子的电子发生跃迁,其能量差作为特征X射线放出,部分X光子经能谱探头窗口被接收,在硅漂移探测器(SDD)产生电子-空穴,由此产生的微小电荷脉冲由前置放大器处理和转换后经过多道分析器,最终得到一个以通道(能量)为横坐标、以通道计数(强度)为纵坐标的X射线能量色散谱。本文所用仪器能谱采用了多道(可达4 096)脉冲分析器,可分析从能谱分辨率(本仪器为0.127 keV)到40 keV,故而可以同时分析多种元素,且分析速度快,定量和定性分析过程无需等待,比较适合于快速、定点分析。此外,它还有分析体积小,空间灵敏度高等特点。不过能谱分析时,也要关注逃逸峰、和峰、内部荧光峰和重叠峰等问题。牙釉质作为人体矿化程度最高的组织,主要成分是羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAP,Ca10(PO4)6(OH)2),除H以外其他元素(Ca、P和O)都可以被能谱探测到,得到能谱谱图之后只需要点击几下按钮即可快速得到定量结果(指定元素的质量百分比和原子百分比)。

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本研究作者利用球差矫正场发射透射电子显微镜(FEI Titan G260-300,能谱型号为Oxford X-MaxN80T),取商品羟基磷灰石为参照物,以健康牙釉质、龋变牙釉质和牙结石为试材,对其组成成分(特别是P/Ca原子数量比)进行初步探究,后利用SPSSAU进行统计学分析,并讨论了牙釉质的龋变机理。

1 实验材料和方法

1.1 材料

(1)实验材料:完整的人体智齿一颗,窝处有黄褐色龋变,其他部分无明显病变(健康牙釉质);牙结石一块(牙齿上自然脱落、硬质、黄褐色)。

(2)参照物:商品羟基磷灰石(Hydroxylapatite)、99%、针状、CAS:1306-06-5,生产商:河北百灵威超精细材料有限公司。

(3)乙醇(分析纯):国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

球差矫正场发射透射电子显微镜(FEI Titan G260-300),能谱配件型号:Oxford X-MaxN80T,用仪器出厂标配的TEM Imaging and Analysis(俗称TIA)进行能谱采集和成分分析,后利用SPSSAU对所得成分比例进行统计学分析。

2 实验结果与讨论

2.1 实验方法与结果

参照样和试材诸样本均玛瑙研钵研磨并借助乙醇分散,后滴到透射电镜专用网上,自然挥发干燥后进行透射电镜观察。

图1～6为透射电镜EDS谱图示例(含元素原子占比列表),表1是电镜生成EDS谱图之后,由电镜的TIA软件自动计算再由SPSSAU统计的P/Ca原子数量比汇总表。需要说明的是,因所用载网的能谱结果主要为C,含有少量O、Si、Cu(图2),采集各实验材料和参照样本的能谱谱图并作计算时C、O、Si、Cu成分含量会略高于实际数值,而其他元素成分占比会略低,不过因为是在同样的实验条件下测试,不同样本之间具有可比性。

表1 能谱分析样品的P/Ca原子数量比

图1 商品羟基磷灰石的能谱谱图和成分比例

图2 TEM专用铜网上碳膜的能谱谱图和成分比例

图3 健康牙釉质的能谱谱图和成分比例

图4 牙结石的能谱谱图和成分比例

图5 牙结石(有颗粒处)的能谱谱图和成分比例

图6 龋齿的能谱谱图和成分比例

2.2 相关分析方法与相关系数

采用SPSSAU对观测样品的表征指标P/Ca原子数量比进行Pearson线性相关分析,置信区间0.05,Pearson相关系数r以及配对t检验的差异性(p)见表2。

表2 Pearson相关系数r以及配对t检验的差异性

2.3 结果与讨论

2.3.1 P/Ca原子比

(1)羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的理论P/Ca原子比数量为0.6[4],本研究能谱分析参照样品(商品羟基磷灰石,图1和表1)的P/Ca极小值和极大值为0.576 1,0.637 5,均值0.600 3,标准差0.024 4,极值浮动一方面源于样品的位置、尺寸、形貌等差异对能谱信号的影响以及软件拟合方式对P/Ca原子数量比产生的误差。另一方面参照样品本身亦非理想纯净,或本身原子比存在不均匀性。但浮动的标准差0.024 4不大,均值基本上与理论值等同,如此将其作为参考分析对象可行。

(2)健康牙釉质(图3和表1)的P/Ca原子数量比均值0.614 8、大于参照样品2.4%,极小值0.575 8小于参照样品0.05%,极大值0.663 9大于参照样品4.1%,表面看两者P/Ca原子数量比差异小至10-2数量级,但两者的标准差0.029 7与0.024 4的相差幅度达21.7%,即上升至10-1数量级。由此推论,在健康牙釉质结构中,P/Ca原子数量比相对参照样品的分散性显著,这反映出健康牙釉质本身晶体结构应不会是纯粹的羟基磷灰石,内部还可能有其他钙/磷化合物存在。另外,本实验对健康牙釉质除测到P、Ca、O元素外,还检测到少量的Na和Mg[5],虽然Na的原子占数量比未超过1.2%,Mg未超过0.4%,但若Na+和Mg2+替换Ca10(PO4)6(OH)2结构中的Ca2+,因价态或原子尺寸差别,也有可能会引起PO43-/Ca2+的数量比例变化,即P/Ca原子数量比的变化。

(3)牙结石(图4和表1)的P/Ca原子数量比均值0.689 1大于参照样品14.8%,极小值0.395 3小于参照样品31.4%,极大值0.823 5大于参照样品29.2%,更有牙结石的标准差0.149 9五倍于参照样品的标准差0.029 7。这些数据即显示牙结石与参照样品的结构差异,明显大于健康牙釉质与参照样品的结构差异,也显示出牙结石中P/Ca原子数量比的分散性非常剧烈,这正是牙结石之所以为牙垢、为口腔脏物的原因。另外,在本研究实验P/Ca原子数量比为极小值0.395 3牙结石样本中,使用TIA软件自动计算出Na、Mg原子数量比分别为0.06%和0.01%;而在P/Ca原子数量比为极大值0.823 5牙结石样本中,Na和Mg原子数量占比分别为1.05%和1.51%,说明Ca2+与Na+(Mg2+)等正离子也有此消彼长的趋势。实际上P/Ca原子数量比(0.421 2)接近极小值处牙结石样本处,C含量最高(原子数量占比约56.43%,图5),而且此处有部分纳米颗粒析出(如图7,HAADF-STEM形貌图),在这个形貌图中,Ca原子序数最大,相应图像亮度应越大,推测图中纳米尺度的亮点可能是Ca或其化合物,其余主要为C元素。

图7 有部分纳米颗粒析出的HAADF-STEM形貌图

(4)龋变牙釉质(图6和表1)P/Ca均值0.717 1大于健康牙釉质和参照样品16.6%,19.4%,极小值0.315 4小于健康牙釉质和参照样品45.2%,45.2%,极大值1.539 3大于健康牙釉质和参照样品131.8%,141.4%,,标准差0.252 4约8.5倍于健康牙釉质0.029 7,约10.5倍参照样品0.024 4。很明显,龋齿的牙釉质与健康牙釉质的结构差异以及P/Ca原子数量比的分散性,相比牙结石更为显著。

2.3.2 Pearson线性相关分析

根据表2对观测样品表征指标P/Ca原子数量比进行Pearson线性相关分析及其配对t检验的差异性分析结果,可以认为:

(1)龋变牙釉质和牙结石的P/Ca原子数量比在0.05置信水平上显著负相关(0.5≤|r=-0.734 3|≤1.0表示强相关),配对检验差别统计不显著(p>0.05)。

(2)参照样品和牙结石、参照样品和龋变牙釉质均无显著相关关系,但是其配对T检验均有显著差异(p<0.05),说明参照样品和牙结石、参照样品和龋变牙釉质虽然均值差异显著,但是每个数据之间相对独立、无相关关系。

(3)参照样品和健康牙釉质、健康牙釉质和牙结石、健康牙釉质和龋变牙釉质均无显著相关关系,且配对T检验差别统计也不显著(p>0.05)。

3 结论

(1)牙釉质本身晶体结构不是纯粹的羟基磷灰石,实验除测到P、Ca和O,还测到少量的Na和Mg,或因Na+和Mg2+替换Ca10(PO4)6(OH)2结构中的Ca2+引起P/Ca原子数量比的变化。

(2)牙结石有测到比较多C元素的区域,这与食物残渣、人体细胞主要成分为C吻合。

(3)龋变牙釉质和牙结石的P/Ca原子数量比,相比参照样本和健康牙釉质分散性显著,龋变牙釉质更甚。

(4)龋变牙釉质和牙结石的P/Ca原子数量比在0.05置信水平上有显著的负相关关系。

所以本实验结果支持酸源学说,牙菌斑、食物残渣等堆积,若不及时清除慢慢形成牙结石、牙釉质脱矿成龋。保持牙齿清洁卫生、及时清理牙结石或有助于预防牙齿龋变。但是因为龋变牙釉质和牙结石的P/Ca原子数量比表现出显著负相关,或许慢慢矿化的牙结石的P源和Ca源部分来自牙釉质,才会导致龋变牙釉质和牙结石的P/Ca原子数量比此消彼长。