HPLC法测定消炎利胆片中三种成分的含量

李篮,曾志云,姜玉梅,谢佳琦

(湖南化工职业技术学院,湖南 株洲 412000)

消炎利胆片是《中国药典》2020年版收载品种,由穿心莲、苦木、溪黄草3味药组成,具有清热、祛湿、利胆的功效[1],用于肝胆湿热所致的胁肋胀痛、口干口苦;急性胆囊炎、胆管炎见上述征候者。消炎利胆片现行的质量标准,其含量测定项下仅规定了穿心莲活性成分——穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯[2]的含量。穿心莲虽为消炎利胆片的主药,其两个内酯的含量却难以全面反映制剂产品的质量。

研究表明消炎利胆片含量测定的指标成分多达10余种[3-5]。本研究对消炎利胆片的药效物质基础进行了系统梳理与考证,按照“关键药味重点突出、质量控制无盲点”的原则,在原质量标准穿心莲内酯类含量测定的基础上新增酚酸类物质作为含量测定指标成分。酚酸类物质是溪黄草发挥抗炎、抗病毒作用的主要活性成分,其中迷迭香酸发挥了重要作用,而其含量因溪黄草不同产地而表现出较大差异,可作为区分的质量标准之一[6]。故采用HPLC法测定消炎利胆片中迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量,以期建立适合全面控制消炎利胆片的质量标准,为该制剂产品的后续研究提供基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司,美国),Waters sunfire C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm,沃特世科技有限公司,美国) 色谱柱;KQ-50B型超声波清洗器(青岛精诚仪器仪表有限公司,中国);AP225WD电子天平(日本岛津仪器有限公司,日本)。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.2 材料

穿心莲内酯(批号:110797-202010,纯度99.6%),脱水穿心莲内酯(批号:110854-202111,纯度98.9%),迷迭香酸(批号:111871-202007,纯度98.1%),以上均购自中国食品药品检定研究院。18批消炎利胆片样品来自12个厂家,这些厂家分布在全国各地,具体见表1。

2 方法和结果

2.1 流动相的选择

查阅相关文献后[7-12],设计了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液等三种洗脱条件,对比发现乙腈-0.1%甲酸水溶液下色谱峰出峰较多,达到基线分离,峰形对称,保留时间适中,即确定该洗脱条件。

2.2 检测波长的选择

取迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等对照品溶液,在波长190～400 nm间扫描,将各成分在205,225,250 nm下的色谱图进行比较,225 nm下各成分出峰效果较好、基线较稳,故选用消炎利胆片的检测波长为225 nm。

2.3 色谱柱温度的选择

取同一份消炎利胆片供试品溶液,考察不同色谱柱温度对峰面积及峰形的影响,考察温度分别为20,25,30 ℃,结果发现色谱柱温度对峰形影响不大,峰形相对稳定,分离度均大于1.5,故选择室温作为洗脱温度。

2.4 提取溶剂的考察

取供试品3份,每份0.3 g,置具塞锥形瓶中,分别各加水、甲醇、70%甲醇50 mL,超声30 min(300 W,40 kHz),放冷,补足减失的重量,摇匀,过滤,取续滤液,即得[13]。分别吸取上述3种供试品溶液测定,结果发现采用水超声时,有絮状物及沉淀产生,且各峰面积相对较小,而采用甲醇、70%甲醇超声时,各成分的含量较高。且采用70%甲醇的基线更为平稳,即确定以70%甲醇作为其溶剂,结果见表2。

表2 不同提取溶剂对各成分峰面积的影响

2.5 提取方法的考察

取供试品2份,每份0.3 g,置具塞锥形瓶中,分别采用超声和回流的方式进行提取[14]。分别吸取上述2种供试品溶液测定,结果发现超声和回流法,提取效率相当,为节省时间提高效率,建议采用超声法提取样品,结果见表3。

表3 不同提取方法对各成分峰面积的影响

2.6 色谱条件

采用Waters sunfire C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm);流动相选择乙腈(流动相A)-0.1%甲酸水溶液(流动相B),梯度洗脱(0～15 min,20%A;15～20 min,20%A→25%A;25～45 min,25%A→35%A;46～50 min,35%A);流速为1mL·min-1;检测波长:225 nm;柱温为30 ℃;结果各色谱峰分离度均良好,且无干扰。

1.迷迭香酸;2.穿心莲内酯;3.脱水穿心莲内酯。图1 消炎利胆片供试品溶液(A)及混合对照品溶液(B)色谱图

2.7 供试品溶液的制备

取消炎利胆片样品10 片,除去包衣,精密称定,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密量取70%甲醇50 mL溶解样品,密塞,称定重量,超声处理(50 W,40 kHZ)30 min,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.8 对照溶液的制备

精密称取迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量,置容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为对照品溶液(每1 mL含迷迭香酸3.5～350 μg、穿心莲内酯19.6～1 961 μg、脱水穿心莲内酯25.3～2 530 μg)。

2.9 方法学考察

2.9.1 线性关系考察

将配制的迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯不同浓度对照品溶液,按“2.6”项色谱条件进样,分别以上述三种对照品的浓度(μg/mL)为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线并进行线性回归,结果见表4。

表4 线性关系考察结果

2.9.2 精密度试验

取同一批消炎利胆片,按“2.7”项制备供试品溶液,按“2.6”项色谱条件下连续进样6针。计算得到迷迭香酸峰面积的RSD为1.8%,穿心莲内酯峰面积的RSD为1.1%,脱水穿心莲内酯峰面积的RSD为0.9%,说明仪器精密度良好。

2.9.3 稳定性试验

取同一批消炎利胆片,按“2.7”项制备供试品溶液,按“2.6”项色谱条件下0,2,4,8,12,24,48 h分别进行测定。结果:迷迭香酸峰面积RSD为0.9%,穿心莲内酯峰面积的RSD为2.3%,脱水穿心莲内酯峰面积的RSD为2.3%,说明供试品溶液在48 h内稳定。

2.9.4 重复性试验

取同一批消炎利胆片,按“2.7”项分别制备6份供试品溶液,按“2.6”项色谱条件下测定。结果:迷迭香酸平均含量的RSD为3.2%;穿心莲内酯平均含量的RSD为1.8%;脱水穿心莲内酯平均含量的RSD为1.9%,说明该方法的重复性良好。

2.9.5 加样回收率试验

取同一批消炎利胆片,研细,精密称取6份,每份0.15 g,置具塞锥形瓶中,精密加入一定量的迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的对照品,按“2.7”项制备供试品溶液,按“2.6”的色谱条件下测定,计算迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的回收率。结果见表5,表明该方法的准确度较好。

表5 准确度试验结果

2.10 样品含量测定

取表1中的18批样品按“2.7”项下的方法制备供试品溶液,按“2.6”的色谱条件测定,记录色谱峰面积,计算各样中迷迭香酸、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量。结果如表6所示。迷迭香酸含量为0.03～0.48 mg/片,穿心莲内酯含量为3.5～7.6 mg/片,脱水穿心莲内酯含量为1.6～8.9 mg/片。

表6 18批消炎利胆片含量测定结果

3 讨论

消炎利胆片具有清热、祛湿、利胆功效,对热毒炽盛证的急性胆囊炎疗效确切。穿心莲与溪黄草、苦木配伍等在一定程度上能改善胆囊炎,保护肝功能。现代药理研究表明迷迭香酸具有抑菌、抗氧化、抗炎等药理活性;穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯具有显著抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、护肺等生物活性,所以本研究选择内酯类成分和酚酸类成分作为研究对象对消炎利胆片进行考察。

不同厂家的消炎利胆片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量差异不大,范围为7.2～13.6 mg/片,均符合药典的要求。但两者之间的比率差异较大,编号为1,2,5,8,9,10批次的样品中,穿心莲内酯的含量高于脱水穿心莲内酯,尤其是编号为1的批次,这可能与每个厂家的不同工艺设备及其参数有关。不同厂家的消炎利胆片都含有迷迭香酸,但含量存在明显差异。各厂家所使用的溪黄草基原不同可能是其原因之一,文献也记载不同溪黄草基原中迷迭香酸含量具有较大差异[15-17]。因此应当注意该投料药材的来源、生产工艺等。

本研究制定了消炎利胆片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和迷迭香酸三种成分的同步含量测定方法,同时对不同厂家样品的含量差异进行分析。但穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯是穿心莲药材中的特征性成分,迷迭香酸是溪黄草中的主要成分,本研究没有涉及苦木中的特征性成分,下一步本课题组将针对苦木的化学成分继续开展研究,以期能建立更加完善的消炎利胆片质量标准。