顶空气相色谱法测定利伐沙班原料药中甲胺的残留量

王珺,马苗

(南京正大天晴制药有限公司,江苏 南京 210046)

利伐沙班(Rivaroxaban)是由德国拜耳和美国强生联合研发的一种新型口服抗凝血药物,商品名为拜瑞妥(Xarelto),于2008年10月在加拿大和欧盟获得批准上市,2011年7月在美国上市,2009年6月在中国正式上市[1-3]。临床上主要用于择期髋关节或膝关节置换手术的成年患者,以预防静脉血栓形成(VTE);用于治疗成人静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE);用于具有一种或多种危险因素的非瓣膜性房颤成年患者,以降低卒中和体循环栓塞风险。临床试验表明,作为新型的口服抗凝药物比华法林效果更佳,既可预防和治疗静脉血栓,又可预防和治疗动脉血栓,在临床上获得广泛的应用,2022年其在全球销售额达到72亿美元,具有良好的市场价值。

利伐沙班原料工业化合成路线文献[1-3]报道较多,甲胺作为利伐沙班中间体合成工艺中重要溶剂,在多条工业化合成路线中均有使用,其可能残留到原料药中,因此有必要对其残留量进行检测和控制。查阅相关文献[4-6],均未见利伐沙班原料药中的甲胺检测方法的报道。甲胺为含氮有机胺,极性较大,水溶液为中强碱,易挥发,分析检测具有一定的困难,文献中多采用离子色谱法或采用柱前衍生化高效液相色谱法测定[7-9],建立了一种灵敏有效的顶空气相色谱法测定甲胺残留量,实验表明该方法操作简便、准确度高且适用性强,可作为利伐沙班原料药中甲胺的测定方法,为质量控制提供新的技术手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

气相色谱仪(Agilent 7890B)配氢焰离子化检测器(FID)、顶空进样器(Agilent 7897A),电子分析天平(Mettler Toledo XP205DR型,精确度:0.000 01 g)。

1.2 试药

利伐沙班(批号:170301、170302、170303,南京正大天晴制药有限公司);甲胺水溶液(分析纯,国药集团,含量:26.6%,批号:20170314);甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜(色谱纯,TEDIA);乙醇、二氯甲烷(色谱纯,ROE);甲苯(色谱纯,Merck);N,N-二异丙基乙胺(分析纯,北京百灵威)、丙酮、氢氧化钠;(分析纯,国药集团);超纯水(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent CP-Volamine(30 m×0.32 mm);程序升温(起始温度为35 ℃,维持8 min,以每分钟25 ℃的速率升温至200 ℃,维持6 min);载气为氮气;柱流量1.5 mL/min;FID检测器温度220 ℃;顶空进样,顶空瓶平衡温度90 ℃,平衡时间30 min;进样口温度200 ℃;分流比20∶1。

2.2 溶液的制备

溶剂:二甲基亚砜-0.1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比95∶5)。

甲胺对照品贮备液Ⅰ:取甲胺溶液适量,精密称定,用溶剂定量稀释制成每1 mL中约含250 μg的溶液。

甲胺对照品贮备液:精密量取甲胺对照品贮备液Ⅰ,加溶剂溶解并定量稀释制成每1 mL中约含50 μg的溶液。

供试品贮备液:取利伐沙班适量,精密称定,加溶剂适量振摇使溶解,用溶剂稀释制成每1 mL中约含0.1 g的溶液。

甲胺对照品溶液:精密量取甲胺对照品贮备液1 mL,置顶空瓶中,再精密加供试品贮备液1 mL,摇匀,密封,即得。

供试品溶液:精密量取供试品贮备液1 mL,置顶空瓶中,再精密加溶剂1 mL,摇匀,密封,即得。

各潜在溶剂贮备液:分别取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、甲苯、醋酸、N,N-二甲基甲酰胺与N,N-二异丙基乙胺各适量,用溶剂定量稀释制成每1 mL中约含甲醇15 mg、乙醇25 mg、丙酮25 mg、二氯甲烷3 mg、甲苯4.45 mg、醋酸25 mg、N,N-二甲基甲酰胺4.4 mg与N,N-二异丙基乙胺5 mg的溶液,即得。

混合溶剂对照溶液:精密量取“2.2.2”项下甲胺对照品贮备液Ⅰ 2 mL、“2.2.7”项各潜在溶剂贮备液各0.2 mL,置同一10 mL量瓶中,加溶剂稀释至刻度,摇匀;精密量取1 mL,置顶空瓶中,再精密加入供试品贮备液1 mL,摇匀,密封,即得。

各溶剂定位溶液:分别量取“2.2.7”项下各潜在溶剂贮备液各0.2 mL,置不同的10 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,分别精密量取1 mL,置顶空瓶中,再分别精密加入供试品贮备液1 mL,摇匀,密封,即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

分别取空白溶剂、甲胺对照品溶液、混合溶剂对照溶液和供试品溶液,顶空进样分析,记录色谱图,结果见图1。结果表明,空白溶剂和合成过程中潜在残留溶剂均不干扰甲胺检测,甲胺与其他残留溶剂均能有效分离,分离度远大于1.5,本方法专属性良好。

A．空白溶剂;B．混合对照品溶液;C．甲胺对照溶液;1．甲胺;2．甲醇;3．乙醇;4．丙酮;

5．二氯甲烷;6．

N

,

N

-二甲基甲酰胺;7．甲苯;8．

N

,

N

-二异丙基乙胺。

图1 专属性试验气相色谱图

2.3.2 进样精密度试验

取“2.2”项下甲胺对照品溶液,顶空进样分析,记录色谱图,重复进样6次。结果6次峰面积RSD为1.4%,保留时间的RSD为0.0%,表明仪器的进样精密度良好。

2.3.3 检测限和定量限试验

按照“2.2”项下甲胺对照品溶液配制方法逐级稀释配制定量限溶液(信噪比要求为10∶1)和检测限溶液(信噪比要求为3∶1),顶空进样分析,记录色谱图,定量限浓度为0.80 μg/mL,相当于供试品溶液浓度的0.002%,峰面积平均值为1.44,峰面积RSD为19%,保留时间RSD为0.1%,检测限质量浓度为0.50 μg/mL。结果表明方法灵敏度高,可以用于甲胺残留的检测。

2.3.4 线性试验

取“2.2”项下甲胺对照品贮备液Ⅰ 0.5,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5 mL,分别置25 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀,制成系列浓度的线性贮备液。分别精密移取系列浓度的线性贮备液1 mL,分别置顶空瓶中,再精密加入供试品贮备液1 mL,摇匀,密封,制成相当于限度浓度的10%～250%系列线性溶液,每个浓度水平溶液平行制备2份,顶空进样分析,记录色谱图,以进样质量浓度(μg/mL)为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y),进行线性回归分析,得到甲胺的线性回归方程为y=4.458 5x-8.627 4,相关系数r=0.999 6,y轴截距偏差为7.7%,响应因子RSD为23.6%,结果表明甲胺在2.50～62.45 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,甲胺标准曲线见图2。

图2 甲胺标准曲线

2.3.5 准确度试验

分别取供试品各1.0 g,精密称定,置10 mL量瓶中,加溶剂5 mL使溶解,分别加入“2.2”项下甲胺对照品贮备液Ⅰ1.0,2.0,3.0 mL,用溶剂稀释至刻度,摇匀,制成三个不同浓度的加标供试品溶液贮备液,分别取加标供试品溶液贮备液各1 mL,置顶空瓶中,再分别精密加溶剂1 mL,摇匀,密封,配制成相当于甲胺限度浓度的50%,100%,150%加标供试品溶液,顶空进样分析,记录色谱图。结果表明,甲胺的回收率在89.9%～104.0%范围内,平均回收率为97.5%,RSD为6.5%,该方法的准确度良好。

2.3.6 重复性试验

按“2.3.5”项下配制方法平行制备6份含100%限度浓度甲胺加标供试品溶液和对照品溶液,顶空进样分析,记录色谱图。按标准加入法以峰面积计算甲胺含量,加标供试品溶液测定结果平均值为0.045%,RSD为9.8%,结果表明该方法的重复性良好。

2.3.7 中间精密度试验

为考察随机变动因素对精密度的影响,另一名分析员在不同的时间使用不同仪器独立建立系统,按“2.3.6”项下方法重新制备6份加标供试品溶液和对照品溶液,顶空进样分析,记录色谱图。按标准加入法以峰面积计算甲胺含量,计算不同人员在不同时间使用不同仪器测定结果的RSD。12次测定结果平均值为0.046%,RSD为12.8%,结果表明本方法的中间精密度良好。

2.3.8 耐用性试验

按“2.3.5”项下加标供试品溶液配制方法制备含100%限度浓度甲胺加标供试品溶液和对照品溶液,作为耐用性测试溶液,按“2.1”项下色谱条件,对色谱条件中的参数做微小的变动,分别改变起始柱温30,40 ℃,载气流速1.0,2.0 mL/min,分流比15∶1,25∶1,顶空瓶平衡温度85,95 ℃,顶空瓶平衡时间25,35 min,进样口温度195,205 ℃和检测器温度215,225 ℃,取加标供试品溶液和对照品溶液进样分析,各条件下甲胺对照品溶液甲胺峰理论板数均大于20 000、甲胺峰与相邻峰间的分离度均大于1.5,不同条件下供试品溶液中甲胺测定结果与规定条件下测定结果的比值在79.4%～97.8%之间,均能满足测定要求,表明本方法耐用性良好。

2.3.9 溶液稳定性试验

取“2.2”项下甲胺对照品溶液和供试品溶液,立即顶空进样分析,记录色谱图,置室温下放置,分别于第4,8,12,16,24 h进样分析,各时间点甲胺峰面积与0 h峰面积比值在91.8%～100.7%之间,峰面积的RSD为4.3%;供试品溶液在室温放置24 h内,均未检出甲胺峰,且未出现新杂质峰干扰甲胺的测定,结果表明甲胺对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好,可以满足检测需求。

2.3.10 样品测定

取三批利伐沙班原料药(批号:批号:170301、170302、170303),分别按照“2.2”项下配制供试品溶液和甲胺对照品溶液,顶空进样分析,记录色谱图,按标准加入法以峰面积计算甲胺含量,三批供试品中均未检出甲胺。

3 讨论

3.1 甲胺限度的制定

目前《中国药典》2020年版四部通则《0861残留溶剂测定法》[10]和ICH Q3C(R7)《杂质:残留溶剂的指导原则》[11]中均未收载甲胺的限度要求,文献[8-9]报道按照鉴定限度0.10%来控制原料中甲胺残留量,《美国药典》40(USP 40)中Gadodiamide(钆双胺)原料中甲胺控制限度为不得过0.05%[12],为了保证药品的安全性,严格控制利伐沙班中甲胺残留量,因此将甲胺的限度拟定为0.05%。

3.2 色谱柱的选择

根据待测溶剂甲胺的性质,其为含氮有机胺,极性较大,水溶液为中强碱,易挥发,本方法建立过程中分别考察了不同色谱柱,最终选择了挥发性胺类专用色谱柱Agilent CP-Volamine(30 m×0.32 mm)进行分析,其内部具有非极性固定相涂层,凭借多功能脱活技术可以获得对称的峰形,即使在样品水分含量很高时仍然可以获得满意的结果。

3.3 溶剂的选择

根据利伐沙班的溶解性特点,其属于难溶性药物,在水及常规有机溶剂中的溶解度均较差,参考文献[4-5]筛选溶剂,优选二甲基亚砜(DMSO)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)为候选供试品配制溶剂。考虑到甲胺为有机胺,水溶液为中强碱,在原料中可能会以盐的形式存在,游离挥发较少,给检测分析带来困难,为提高检测效率和灵敏度,尝试在溶剂中加入一定量氢氧化钠溶液来提高检测灵敏度,本方法建立过程中考察了溶剂①二甲基亚砜-0.1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比90∶10)、②N-甲基吡咯烷酮-0.1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比90∶10)、③二甲基亚砜-1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比99∶1)、④二甲基亚砜-0.1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比95∶5)、⑤二甲基亚砜-0.1 mol/L氢氧化钠溶液(体积比98∶2),结果发现利伐沙班在溶剂①、②中不能完全溶解,在溶剂③中放置一段时间后析出,溶剂④中比溶剂⑤甲胺峰形更好,且有助于甲胺的测定,因此选择溶剂④作为配制溶剂。

3.4 进样方式的选择

考虑到在溶剂中加入强碱氢氧化钠来增加甲胺测定的灵敏度,采用直接进样方式对仪器进样口和色谱柱会有一定的污染,优先采用顶空进样方式测定残留溶剂。

3.5 定量计算方式的选择

外标法为残留溶剂测定中常用的定量方法,本方法建立过程中尝试采用外标法定量,在准确度试验中发现供试品与对照品处于不完全相同的基质中,存在气液平衡过程中的基质效应,加标供试品中甲胺峰面积为对照品溶液中甲胺峰面积的85%左右,因此选择标准加入法定量来消除基质效应对测定结果的影响,使定量结果更准确。

4 结论

本文所建立的测定利伐沙班原料药中甲胺残留量的方法可确保甲胺色谱峰和原料中其他潜在溶剂色谱峰的分离度满足气相色谱测定要求,专属性良好,操作简便,准确度高、稳定性好,能够满足日常药品质量控制的需要,对于保障药品质量和用药安全具有重要的意义,也可为其他原料中甲胺的测定提供了参考。