高效液相质谱联用法测定苯磺酸氨氯地平中潜在致突变杂质

陈云秀,沈幼红,宋慧慧,李恒,檀璐阳,贾飞,娄晓芬*

(1.大红鹰药业股份有限公司 药物研发中心,浙江 宁波 315040;2.杭州百诚医药科技股份有限公司,浙江 杭州 310000)

高血压是一个全球性健康问题,是导致心脏病和中风的主要因素。如果患者的血压不能被控制,与之相关联的中风和冠状动脉病的患病风险也将随之增加[1]。苯磺酸氨氯地平作为新一代二氢吡啶类钙通道阻滞剂,为长效抗高血压药物,可有效防止钙离子跨膜流入到心肌和血管平滑肌,使外周动脉血管产生扩张作用。苯磺酸氨氯地平对原发性高血压和心绞痛具有良好的治疗效果[2-3]。苯磺酸氨氯地平化学名称:(±)-2-[(2-氨基乙氧基)甲基]-4-(2-氯苯基)-1,4-二氢-6-甲基-3,5-吡啶二羧酸-5-甲酯,3-乙酯苯磺酸盐。

近年来,药物成分和药品中潜在的致突变杂质问题备受关注,制药行业和监管机构已经认识到潜在致突变杂质对人类健康和监管问题的重要性。欧洲药品管理局(EMA)、美国食品药品监督管理局(FDA)及人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)先后颁了潜在致突变杂质控制的指导文件,推荐按毒理学关注阈值(TTC,1.5 μg/d)来控制用药风险[4],TTC 1.5 μg/(人·d)是被可接受的风险范围。然后通过适当的检测方法检测药物中潜在致突变杂质的种类和含量,确保药品质量。

通过查阅苯磺酸氨氯地平的合成文献[5-6]可知,该合成工艺过程中可能会有潜在致突变杂质生成,其中苯磺酸酯类致突变杂质[7]的研究已有相关报道,此处不再详细描述。对照致突变警示结构[8-9],我们对其他可能的潜在致突变杂质进行了评估分析,并开展相关研究工作。应用TOXTREE和VEGA软件对可能具有致突变警示结构的反应物料和中间体进行计算机模拟的毒性评估。结果显示,乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(合成中间体)KNN/Reas-Across评估结果呈Ames阳性,为可能的潜在致突变杂质。具体评估结果如表1所示。

基于TTC,根据苯磺酸氨氯地平每日最大服用剂量为10 mg可知,潜在致突变杂质乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯(本品为高血压长期治疗用药物,服药周期长,按照服药期间超过10年计算)的可接受限度:(1.5 μg/d)÷(0.01 g/d) =150×10-6。

本研究主要通过高效液相色谱-质谱联用法对乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯杂质进行分离和测定,并按照相关技术指导原则要求进行方法学验证。

表1 潜在致突变杂质评估结果

1 仪器与试药

1.1 仪器、设备

液相色谱-质谱联用仪(赛默飞, U3000+ISO);电子天平(赛多利斯,Secura 125-CN);超声仪(GC Sonic,VGT)。

1.2 试剂、试液

甲酸(国药集团化学试剂有限公司,AR级);乙腈(TEDIA,HPLC级),乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯对照品(上海毕得医药科技有限公司,97.52%);苯磺酸氨氯地平(宁波大红鹰药业股份有限公司)。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:填料为十八烷基硅烷键合硅胶(Agilent Zorbax SB-C184.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;进样量:10 μL;流速:1.0 mL/min;流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0～5 min,B相从50%线性升至90%;5～7 min,B相保持90%;7～7.1 min,B相从90%线性将至50%;7.1～12 min,B相保持50%。

2.2 质谱条件

裂解方式:碰撞诱导解离(CID);雾化温度:450 ℃;离子传输管温度:300 ℃;正离子电压:3 000 V;负离子电压:-2 000 V;鞘气:65 psi;辅助气:9 psi;吹扫气:0.5 psi;扫描名称:1;质量列表或范围(amv):320;极性离子:阳性;源内诱导解离电压:20 V。

2.3 浓度计算

精密量取对照品溶液、供试品溶液各10 μL分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品色谱图中如有与待测成分保留时间一致的色谱峰,按外标法以峰面积计算,样品中乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯不超过0.015%(即150×10-6)。

3 方法学考察

3.1 对照品及供试品溶液配制

稀释剂(空白溶液)为90%乙腈。

精密称取本品适量,用稀释剂溶解并定量稀释成每1 mL约含1 mg的溶液作为供试品溶液(浓度1.0 mg/mL)。

精密称取乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯适量,用稀释剂溶解,并稀释配成每1 mL约含1.5 μg的溶液作为对照品储备液(1.5 μg/mL)。取对照品储备液适量,用稀释剂稀释配成每1 mL约含0.15 μg的溶液作为对照品溶液(0.15 μg/mL)。

精密称取样品适量置于量瓶中,加入适量稀释剂溶解后再加入对照品储备液,用稀释剂稀释至刻度,作为加标供试品溶液(溶液中样品浓度为1.0 mg/mL,对照品质量浓度为0.15 μg/mL)。

3.2 系统适用性与仪器精密度

取对照品溶液连续测定6次,计算峰面积RSD和保留时间RSD,考察系统适用性和仪器精密度。结果显示,6次测定的峰面积RSD为1.2%,保留时间RSD为0.1%,表明系统适用性和仪器精密度良好。

3.3 专属性

精密量取“3.1”节项下的溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。结果显示,空白溶液无干扰。供试品溶液、加标供试品溶液与对照品溶液待测峰保留时间一致,乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯与各杂质峰能有效分离,该方法专属性良好。

3.4 检测限(LOD)和定量限(LOQ)

将对照品溶液逐级稀释,按“2.1”节色谱条件进样,取基线噪声的3倍以上(信噪比S/N≥3)值作为最低检测限,取基线噪声的10倍(信噪比S/N≈10)值作为最小定量限。检测限为0.009 2 ng,定量限为0.030 5 ng。

色谱图如下:

图1 检测限和定量限图谱

3.5 线性和范围

取对照品储备液,用稀释剂稀释成质量浓度为0.003 1,0.030 5,0.076 3,0.122 0,0.152 5,0.228 8 μg/mL的线性溶液,分别取上述溶液,按照“2.1”节色谱条件进样,记录峰面积,以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,线性曲线方程为y=27 384.531 2x+31.838 0,相关回归系数r=0.999 9。结果表明,乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯在0.003 1～ 0.228 8 μg/mL质量浓度范围内,峰面积与浓度呈良好线性关系。

3.6 准确度

取苯磺酸氨氯地平样品和对照品贮备液,用稀释剂配制成LOQ:50%,100%,120%水平体积分数溶液。每种水平溶液平行配制3份,分别测定其含量,将实测值与理论值进行比较,计算回收率。结果如表2所示,LOQ水平回收率RSD=4.1%,50%～120%水平回收率RSD=2.8%。结果表明本方法可准确测定供试品溶液中乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯的量,准确度良好。

表2 方法学验证结果——准确度

3.7 精密度

3.7.1 重复性

平行配制6份加标供试品溶液,由同一分析人员在尽可能相同的条件下进行测定,计算测得量及RSD。结果显示,重复性6份样品溶液测得量RSD为2.4%,该方法具有良好的重复性。

3.7.2 中间精密度

配制6份加标供试品溶液,由另一名分析员在不同的日期进行测定,计算测得量及RSD,同时与重复性试验共12份测定结果合并计算。实验结果如表3所示,中间精密度6份样品溶液测定结果RSD为1.7%;重复性与中间精密度结果合并计算,12份样品中测定结果RSD为2.2%,该方法的精密度良好。

表3 方法学验证结果——中间精密度

3.8 耐用性

3.8.1 溶液稳定性

精密量取“3.1”项下对照品溶液和加标供试品溶液,分别于0,4,8,15,25 h进样检测,记录色谱图,计算峰面积RSD。结果显示,不同时间色谱峰面积基本一致,对照品峰面积RSD=9.2%,加标供试品溶液峰面积RSD=9.3%。表明对照品溶液室温放置25.0 h稳定,加标供试品溶液室温放置24.8 h稳定。

3.8.2 耐用性研究-色谱条件变动

取“3.1”项下空白溶液(稀释剂)、供试品溶液、对照品溶液和加标供试品溶液(平行两份)各10 μL,按“2.1”节的色谱条件进样。通过改变柱温(30±5)℃、初始梯度((50∶50)±5%)、柱流速(1.0±0.2)mL/min、流动相A甲酸加入量(1 000±200) μL/(1 000 mL)等条件,考察测定组分测得量与初始条件下测得量的RSD。结果如表4所示。

表4 方法学验证——耐用性试验结果

实验结果显示,柱流速0.8～1.2 mL/min条件下,加标供试品溶液中测得量RSD=2.9%;初始梯度V(A)∶V(B)=45∶55～55∶45条件下,加标供试品溶液中测得量RSD=3.3%;柱温25～35 ℃条件下,加标供试品测得量RSD=2.7%;甲酸加入量0.08%～0.12%条件下,加标供试品溶液测得量RSD=2.5%。结果表明该方法对流速、初始梯度、柱温、流动相A中甲酸加入量的微小变化耐用。

3.9 样品测定结果

取9批苯磺酸氨氯地平原料药,按照“3.1”节项下配制样品溶液,并按照“2.1”节项下色谱条件进样,分别测定乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯含量,检测结果显示,多批次样品中均未检出该杂质,即杂质在原料药中的含量远远低于M7指导原则中潜在致突变杂质的限度。

4 结果讨论

高效液相-质谱联用(LC-MS)法具有简单高效、专属性强、重复性好,准确度高等特点,可以对样品中的杂质残留进行有效地检测和分析。

该方法可以在较短时间(杂质出峰时间在4.7 min左右)内对苯磺酸氨氯地平中潜在致突变杂质乙基-4-(2-邻苯二甲酰亚胺基乙氧基)乙酰乙酸乙酯进行有效检测。方法学验证结果表明,该方法耐用性良好,可有效用于常规的样品检测,确保该方法的数据可靠性。本方法能保证杂质残留的可控性,为苯磺酸氨氯地平的质量控制和后续研究提供有力保障。