达立通颗粒运用网络药理学对功能性消化不良作用机制的探讨

陶琳,赵晗宇,刘朝青,张芳

(1.南昌弘益药业有限公司,江西 南昌 330096;2.江西中医药大学,江西 南昌 330004)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是指伴有上腹痛、胀,嗳气,食欲不振等临床症状的一种临床常见功能性胃肠病,可分为运动障碍型、溃疡型及非特异型[1]。全世界FD的患病率较高,西方国家约10%～40%,亚洲国家约5%～30%[2]。而FD发病机制并未明确。西医多认为FD与肠胃动力障碍、内脏敏感过度、社会心理因素、十二指肠黏膜病症、幽门螺旋杆菌感染等有关[3]。

在FD的治疗上,中医认为宜在通利消滞和胃降逆的基础上,佐以清热解郁之剂。达立通颗粒处方则是根据古人“腑气以通为用”的原则研制而来,处方是由柴胡、枳实、木香、陈皮、清半夏、焦山楂、焦槟榔、鸡矢藤、党参、延胡索、六神曲、蒲公英组成,方中12味中药材都具有调节胃肠功能、促进消化之功效。

网络药理学是近年来兴起的一门具有“多基因、多靶点”特点的药理学分支学科,展示了疾病与相关靶点的复杂关系,为疾病发病机制与治疗提供新思路,是中药学科研究的前沿和焦点。本文对达立通颗粒进行网络药理学分析,探究达立通颗粒对FD得作用机制。

1 资料与方法

将达立通颗粒中12味中药名称输入TCMSP数据库并结合文献检索,搜集12味中药材的活性化学成分,筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%,成药相似性(DL)≥0.18,将活性化学成分2D结构输入Swiss Institute of Bioinformatics数据库中进一步筛选。将搜集到的活性化学成分通过PubChem数据库和Swiss Institute of Bioinformatics数据库中的SwissTargetPrediction进行潜在靶点的搜集。通过网络图像化软件Cytoscape 3.7.2构建“活性化学成分靶点”互相作用网络图。采用DRUGBANK数据库、GENECARDS数据库、TTD数据库,在数据库中搜集与FD相关的靶点基因,整理后建立FD相关靶点数据集。剔除重复靶点后,经过Venn分析,得到达立通颗粒潜在作用FD靶点基因,构建“中药-化学成分-靶基因-疾病”网络图。用数据库String检索潜在作用FD的靶点基因,得到蛋白之间的互相作用信息,通过Cytoscape3.7.2软件对靶点蛋白质-蛋白质互作关系(PPI)网络进行分析。将疾病-药物成分共同靶点基因导入DAVID数据库,进行GO功能富集分析,选择生物过程(biological process,BP)/细胞组(cell component,CC)/分子功能(molecμLar function,MF)排名前十的通路,绘制条形图;进行KEGG信号通路富集分析,设置P<0.05,剔除广泛通路后,得到排名靠前的重要通路绘制气泡图。通过PDB数据库和ZINC数据库分别搜集度值(degree)排名靠前的蛋白质和小分子配体,AutoDockTools1.5.6进行分子对接(若结合能<0,表明配体分子均能和受体蛋白自发地结合),并将打分结果通过GraphPad Prism8生成热图,将打分最高的结果通过PyMol2.5生成分子对接图。

2 结果

2.1 主要活性化学成分的筛选与搜集

通过TCMSP数据库和文献报道,经OB、DL条件按筛选共得到活性化学成分71个(图1)。

图1 达立通颗粒活性化学成分网络

2.2 活性化学成分潜在靶点的搜集

通过数据库检索得到活性化学成分去重后对应的903个作用靶点。通过软件Cytoscape3.7.2将候选活性成分和靶点相连,该网络由984个节点,6 771条边(图2)。

图2 达立通颗粒“活性化学成分靶点”相互作用网络

2.3 FD疾病靶点的搜集及与达立通颗粒作用靶点Venn分析

通过DRUGBANK等数据库建立FD相关靶点数据集,剔重之后,共搜集到592个FD疾病相关靶点。经过Venn分析活性成分对应的903个作用靶点与592个FD疾病相关靶点,得到达立通颗粒潜在作用FD的133个靶点基因。进而运用Cytoscape3.7.2软件得“中药-化学成分-靶基因-疾病”网络图(图3)。

图3 “中药-化学成分-靶基因-疾病”网络图

2.4 生物分子网络建立

通过String数据库检索133个Venn分析得到得靶点,利用软件Cytoscape对靶点PPI网络进行分析。其中degree排名前5的靶点为PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC,可认为是达立通颗粒治疗FD的核心靶点(图4)。

图4 靶点蛋白质-蛋白质互作关系图

2.5 富集分析

将核心靶点导入DAVID数据库进行GO功能、KEGG通路分析,GO功能分析的BP/CC/MF各有133个生物过程,选取各排名前十的通路做条形图。其中BP富集结果有RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、细胞增殖正调控等。CC富集结果有质膜、细胞核等。MF富集结果有蛋白质结合、ATP结合等。

KEGG信号通路富集分析得到125条通路,选取排名靠前的20条富集较大通路做图(图5)。富集结果所涉及通路有PI3K/AKT信号通路、Rap 1信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT通路等。

图5 EGG信号通路富集分析

2.6 分子对接结果分析

选取五个关键靶点与五个活性有效成分进行分子对接,绘制热图(图6)。由图可知:MAPK1和山柰酚(kaempferol)结合力最高,打分为-3.38,其次是SRC和橙皮素(Hesperetin)为-2.94。并给予结合能力最高的MAPK1与山柰酚绘制分子对接图(图7)。

图6 分子对接打分热图

图7 MAPK1和山柰酚分子对接图

3 讨论与小结

本研究通过数据库和文献报道,筛选后得到达立通颗粒活性化学成分71个。在133个与FD有关的潜在靶基因中,黄酮类活性成分作用靶点占绝大部分,如山柰酚、橙皮素、槲皮素等。黄酮类化合物在自然界分布广泛,且对于功能性消化不良患者治疗效果显著[4]。

从PPI图可知degree排名前5的靶点分别为PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1、SRC。在KEGG通路富集中,所涉及通路有PI3K/AKT通路、Rap 1通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等。

PIK3CA作用于PI3K-AKT通路。AKT1为AKT类型之一,是PI3K-AKT信号通路调节的重要一环[5]。响应细胞外信号,PI3K-ATK通路通过磷酸化调控其下游通路eNOS,产生NO。在FD发病机制中NO和其代谢物的影响极为重要,作用于胃肠道平滑肌,导致胃肠道蠕动减少[6]。AKT的表达可激活NF-κB(核因子κB),加强释放炎症因子,引起胃黏膜损伤[7]。

STAT3经刺激后可作用于Jak/STAT通路调节多种基因表达。十二指肠、抑郁与FD发病有关,FD患者伴随十二指肠的低度炎症且更易产生抑郁倾向[8-9]。分布广泛的Jak/STAT信号通路是参与免疫反应、炎症反应的重要部分,有实验表明,调节此通路,可降低炎症因子水平,促进肠黏膜修复减轻损伤[10],可降低中枢炎症反应,产生抗抑郁作用[11]。

MAPK1(又称ERK2)为MAPK信号传导的关键调节因子。Rap 1主要是影响ERK信号传导通路调控基因表达[12]。ERK通路是MAPK诸多通路之一,参与炎症反应且与抑郁相关。MAPK通路通过磷酸化ERK1/2等信号分子,进而调节相关炎症因子表达。在FD发病表现中,上腹痛症状与幽门螺旋杆菌感染最相关[13],幽门螺旋杆菌可通过激活ERK1/2信号通路,引起炎症因子过度表达,胃黏膜产生持续损伤[14]。ERK1/2信号通路调控下游脑源性神经影响因子表达,可对抑郁产生影响[15]。

经以上分析可知,关键靶点分别与富集较大通路相对应,PI3K-AKT信号通路参与炎症反应,调节产生NO,影响胃肠道动力。Jak-STAT信号通路调节炎症因子水平,影响黏膜损伤,改善抑郁。MAPK信号通路可调控炎症反应,抑郁和疼痛敏化。结合分子对接结果表明活性成分与作用靶点结合能力强,表明运用网络药理学对达立通颗粒治疗FD作用机制研究可行。

综上所述,本研究提示达立通颗粒活性成分作用于PIK3CA、AKT1、STAT3、MAPK1等相关靶点,通过PI3K/AKT通路、MAPK通路、Jak-STAT通路等多个通路,调节炎症反应、胃肠动力、抑郁情绪等作用治疗FD。揭示了达立通颗粒治疗FD的复杂分子网络关系,从理论层潜在分析了达立通颗粒治疗FD的作用机制,体现了达立通颗粒多成分、多靶点、多通路协同治疗FD的特点,为中医药治疗FD的作用机制提供科学依据。但本研究仅在网络药理学的基础上预测药物对疾病的作用机制,还需进行相关实验,深入探究其具体作用机制。