正交试验法优化超声提取荷叶中荷叶碱工艺研究

柴莎莎,徐圣

(武汉职业技术学院 生物工程学院,湖北 武汉 430074)

荷叶,又称莲径或者莲花径,是睡莲科莲属多年生草本挺水植物莲荷的叶[1]。2015版《中国药典》记载,荷叶性平,味苦,归肝、脾、胃经,具有清暑化湿、凉血止血等功效,主要用于暑热烦渴,脾虚泄泻等[2]。现代药理学研究表明,荷叶还具有明显的降血脂、降血压、平衡胆固醇等生理活性[3]。在食用方面,人们将荷叶入茶达到滋补养生的目的,有些菜肴的制作也用到了荷叶[4]。

我国荷叶资源丰富,荷叶价格低,易获取,作为天然药用植物资源有很大的潜力。但是目前荷叶利用率很低,仅有极小部分用于临床治疗或加工成保健食品。荷叶产业发展与精准扶贫相结合,具有巨大生态效益、经济效益和社会效益。在中华人民共和国卫生部卫监发布的(1991)第45号文件中,荷叶在第二批药食同源的名单中[5],这为荷叶产品的研发和产业链拓展到药品、食品领域提供了政策支撑。

在荷叶众多的化学成分中,生物碱是荷叶主要有效成分之一[6],具有抑制胆固醇生产、降血脂、抗菌和抗氧化等活性[7],因此,可将其应用于医疗或保健食品中,有很大的市场潜力。荷叶碱在荷叶中含量较多,是荷叶中的特征生物碱,成为近年来研究的热点。

本研究以荷叶为原料,利用超声波法提取荷叶碱,利用单因素实验法对不同提取条件对荷叶碱提取率的影响进行了研究,设计正交试验优化荷叶中荷叶碱的提取条件,旨在获得最佳的提取条件。旨在为今后荷叶食品的开发、加工应用及质量控制提供物质基础研究,对荷叶食品化工产业健康发展具有重要的参考意义。

1 实验材料和方法

1.1 材料

荷叶碱标准品,纯度98%,成都普思生物科技股份有限公司;乙腈,色谱纯,上海业坦化工科技有限公司;甲醇,色谱纯,上海业坦化工科技有限公司;三乙胺,色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;冰乙酸,分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;荷叶,采摘于湖北武汉、洪湖、随州、鄂州地区,粉碎干燥后,常温密封备用。

1.2 分析测试仪器

高效液相色谱仪,1260型,美国安捷伦有限公司;电子微量天平,XS205DU型,METTLER TOLEDO有限公司;超声波清洗机,SB-800D型,宁波新芝有限公司;旋转蒸发仪,RE- 501EX型,郑州凯瑞仪器设备有限公司;电热鼓风干燥箱,HD-E804-55,武汉海达国际仪器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 色谱条件

检测器:DAD;色谱柱:ZORBAX C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:A-乙腈;B-水溶液(2%三乙胺+1%冰乙酸)体积比=50∶50;时间:18 min;流速:0.8 mL/min ;检测波长:270 nm;柱温:30 ℃进样量:5 μL。

1.3.2 荷叶碱标准溶液配制

精密称取荷叶碱标准品5 mg,加甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中。

精密量取标准溶液至10 mL容量瓶中,使用甲醇溶液定容,进液相进行测定。以荷叶碱系列标准溶液的浓度为横坐标,荷叶碱标准品对应峰的峰面积为纵坐标,制作标准曲线。

1.3.3 试样溶液的测定

将荷叶碱提取后,使用旋转蒸发仪对荷叶碱提取液进行浓缩,放入干燥箱中进行干燥,精密称取干燥后的荷叶碱,记录重量。将荷叶碱置于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,过0.25 μm有机滤膜,注入液相色谱中,进行测定,记录荷叶碱特征峰面积,使用标准曲线法计算荷叶碱含量。

1.3.4 荷叶碱提取工艺优化

1.3.4.1 提取方式优化

考察索氏抽提法、冷凝回流法和超声提取法对提取荷叶碱含量的影响,使用相同的提取条件:80%乙醇体积分数、提取温度80 ℃、提取时间2 h、料液比1∶20(g∶mL),将同一批荷叶提取后的荷叶碱样品定容至100 mL容量瓶中,按1.3.1的方法测定提取液中荷叶碱的含量。

1.3.4.2 提取条件优化

将乙醇体积分数(40%,50%,75%,85%,100%)、提取时间(30,60,90,120,150 min)、提取温度(40,50,60,70,80 ℃)、料液比(1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30(g∶mL))、超声功率(40,50,60,70,80 W)作为单因素实验,探究其对荷叶碱得率的影响。

根据单因素实验结果,选取对荷叶碱提取率影响较大的因素做正交试验,优化提取条件。

2 实验结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取方式

采用80%乙醇体积分数、提取温度80 ℃、提取时间2 h、料液比1∶20(g∶mL),超声功率60 W的相同提取条件下,使用超声提取的方式荷叶碱得率最高,其次为索氏抽提法,冷凝回流法荷叶碱得率最低。选用超声提取作为提取荷叶碱的方式。

2.1.2 乙醇浓度

由图1可知,荷叶碱提取率受乙醇浓度的影响较大,荷叶碱提取率随着乙醇浓度的增加,荷叶碱的提取率也随之上升,乙醇体积分数为75%时荷叶碱提取率达到最大值,此后乙醇浓度增加了,反而荷叶碱的提取率下降了,这可能是由于荷叶碱在75%乙醇体积分数时溶解度最大,因此选用75%乙醇体积分数作为荷叶碱的提取条件。

图1 乙醇体积分数的比较

2.1.3 提取时间

由图2可知,荷叶碱提取率随着提取时间的增长呈上升的趋势,到60 min达到最大,超过60 min后,开始下降,同时考虑到长时间较高温度条件下提取可能会使荷叶碱变质分解,因此从节省能源同时保证荷叶碱较高提取量的角度出发,选取60 min作为荷叶碱的提取条件。

图2 提取时间的比较

2.1.4 提取温度

由图3可知,荷叶碱提取率随着提取温度的升高呈上升的趋势,当温度上升到70 ℃后,荷叶碱提取率上升缓慢,当温度高于80 ℃(乙醇的沸点为78 ℃)将有乙醇蒸发,稳定再升高对荷叶碱的提取率影响较小,因此选取温度70 ℃作为荷叶碱的提取条件。

图3 提取温度的比较

2.1.5 料液比

由图4可知,荷叶碱提取率随着料液比的增加呈上升的趋势,当料液比为1∶20(g∶mL)时,荷叶碱的提取率最高,因此选取料液比为1∶20(g∶mL)作为荷叶碱的提取条件。

图4 料液比的比较

2.2 荷叶碱提取条件的正交试验

根据单因素实验结果,选取对荷叶碱提取率影响较大的四个因素即乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比做正交试验,每个因素选取三个水平。正交试验因素水平表见表1。根据设计的因素水平表进行L9(34)正交试验,其结果见表2。

表1 荷叶碱提取条件正交试验因素水平表

由表2可知,四个因素对荷叶碱得率的影响大小为:A>B>D>C即乙醇浓度>提取时间>料液比>提取温度。通过正交试验得到的最佳提取条件为A1B2C3D2,即乙醇体积分数为75%,提取时间60 min,提取温度70 ℃,料液比20 mL/g。

按照得到的最佳提取条件提取荷叶中的荷叶碱,进行验证试验,得到荷叶碱的得率为0.059 7%,这说明正交试验结果准确。

表2 荷叶碱提取条件正交试验结果

2.3 湖北不同地区荷叶中荷叶碱含量测定结果

使用正交试验得到的最佳提取条件对湖北不同地区10批荷叶进行提取,提取后按照1.3.1～1.3.3的方法测定荷叶碱的含量,结果见表3。

表3 不同地区荷叶中荷叶碱含量

由表3结果可知,不同产地的荷叶碱含量差别很大,其中湖北武汉的荷叶样品中荷叶碱含量最高,其次为洪湖地区的荷叶样品。

3 结论

超声提取方法是一种快速提取荷叶中荷叶碱的优良方法,本研究以荷叶为原料,用超声辅助提取荷叶碱,使用液相方法检测荷叶碱得率,采用单因素试验探究不同提取条件对荷叶碱得率的影响,通过正交试验确定了荷叶碱的最佳提取工艺为:乙醇体积分数为75%,提取时间60 min,提取温度70 ℃,料液比1∶20(g∶mL)。使用优化好的提取条件提取并测定了10批湖北不同地区的荷叶样品中荷叶碱的含量,发现不同产地的荷叶碱含量差别很大。但是样品量较小,不能代表整个地区的荷叶水平,后期可用此最佳提取条件测定更多批次的荷叶中的荷叶碱,为荷叶药材质量控制及其在保健食品中的开发提供参考。