融合基因在唾液腺肿瘤中的研究进展

郑鑫, 程帅, 姚瑶, 张园

恶性肿瘤中染色体易位和重排可以形成融合基因,导致全长癌基因过表达或产生嵌合癌蛋白[1]。鉴定和表征融合基因已为研究疾病的发病机制提供了新的分子基础,协助改进了疾病的诊断和分类,并已证明是分子导向治疗的有效靶点。

唾液腺肿瘤是人类肿瘤中最多样化的肿瘤之一,亚型之间的重叠特征和异质性使鉴别诊断难度增加且临床行为差异较大。局部肿瘤的主要治疗方法是手术联合辅助放疗,由于唾液腺的解剖部位及部分唾液腺恶性肿瘤的侵袭性常使得肿瘤无法切除或切除不完整,存在肉眼残留病灶或阳性切缘,复发和转移发生时治疗效果和预后均不佳[2]。随着下一代测序的应用,唾液腺肿瘤中发现的融合基因越来越多,有助于发掘亚型特异性诊断生物标志物和可靶向的分子改变,但已报告的融合基因常常没有得到充分的表征和总结。本文对唾液腺肿瘤中融合基因的类型、机制及药物研究进展进行综述。

1 融合基因在唾液腺肿瘤中的类型

已发现的典型唾液腺肿瘤的融合基因类型见表1。

表1 唾液腺肿瘤的融合基因类型

高达80%的黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)存在涉及MAML2基因的融合[3],CRTC1-MAML2最为常见,CRTC3-MAML2发生率为5%[4]。CRTC1-MAML2可产生由N端为CRTC1的CREB结合域与C端为MAML2的转录激活结构域组成的嵌合蛋白[5],CRTC1和CRTC3同属保守的CRTC真核蛋白质家族并作为CREB 共激活因子。

超过70%的腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)存在涉及MYB或MYBL1基因的融合,常见的融合伴侣均为NFIB基因。MYBL1是MYB的同源物并以互斥的方式与NFIB融合,它们有共同的基因特征和致癌功能[6]。MYB基因融合可在高达60%的病例中发现,编码c-Myb蛋白[7];MYBL1基因编码a-Myb蛋白,其结构与c-Myb几乎相同[8]。MYB-NFIB的突出特点是断点位置高度可变[9],这使得多种融合转录变体生成并增加识别难度。

NR4A3基因是许多肿瘤类型中的癌基因和抑癌基因,在腺泡细胞癌(acinic cell carcinoma,AciCC)中涉及NR4A3基因的融合可能通过交换调控序列发挥致病作用,而非形成嵌合蛋白[10-11];表1中见于AciCC 的NR4A2和NR4A3均为属于NR4A亚家族的基因调节因子。HTN3-MSANTD3在AciCC中的发生率<5%[12],可驱动其全长3’融合伙伴过度表达,使参与蛋白质翻译的基因显著上调[13],而蛋白质合成增加是癌症的一个共同特征。

唾液腺分泌癌(secretory carcinoma,SC)伴有特征性ETV6-NTRK3[14]。随着报告病例越来越多,ETV6与非NTRK3基因融合(ETV6-X)及其他融合也逐渐检出,其中ETV6-MAML3与MEC中CRTC1/CRTC3-MAML2的MAML3、MAML2同属MAML家族[15],该家族是正常发育和肿瘤发生中发挥多种关键作用的Notch信号传导的转录共激活因子[16]。

透明细胞癌(clear cell carcinoma,CCC)中常见EWSR1-ATF1[17],该融合还见于透明细胞肉瘤[18-19]及血管瘤样纤维组织细胞瘤等[20]。EWSR1与CREB1、CREM融合亦见于CCC[21-23],且CREB1、CREM和ATF1同属CREB转录因子家族[24]。EWSR1作为5’融合伙伴有许多融合类型,在唾液腺肿瘤中涉及EWSR1的融合还见于MEC、ACC和透明细胞肌上皮癌(表1)。

闰管型是导管内癌(intraductal carcinoma,IC)最常见的一种类型,约一半病例存在NCOA4-RET[25-27];顶浆分泌型融合基因极少且为非复发性融合,但有复杂的突变特征,如PIK3CA、SPEN、ATM和HRAS突变、TP53拷贝数丢失[25,27-29];闰管-顶浆分泌混合型也通常含有RET融合,如TRIM27-RET和NCOA4-RET[25-26,30];嗜酸型IC具有独特的组织学和免疫表型特征,并含有TRIM33-RET融合、BRAF V600E突变[31],但鉴于分子发现的异质性和病例数较少,仍需进一步验证。

在肌上皮癌(myoepithelial carcinoma,MECA)中PLAG1基因重排的发生率较多形性腺瘤(pleiomorphic adenoma,PA)更高[32]。TGFBR3-PLAG1可使全长或近全长的TGFBR3和PLAG1蛋白过表达[32];FGFR1-PLAG1使FGFR1启动子调节全长PLAG1蛋白高表达;其余涉及PLAG1基因的融合在PLAG1蛋白表达方式上多与FGFR1-PLAG1相似。HMGA2基因编码的染色质结合蛋白介导抑制DNA修复、p53诱导细胞凋亡等多种致癌功能转录激活[33],并表现为HMGA2过表达,且融合伙伴可能与MECA无关,但基因突变可能在发病过程中起协同作用[32]。涉及HMGA2基因的融合也见于PA。EWSR1-ATF1在唾液腺肿瘤中多见于CCC,当MECA携带该融合时可认为是透明细胞MECA,且预后不佳[34]。

唾液腺导管癌(salivary duct carcinoma,SDC)缺乏稳定发生的基因融合,已发现的融合与MEC、ACC、IC等存在重叠;多形性腺瘤癌变(carcinoma ex pleomorphic adenoma,CXPA)中检出的基因融合与MECA、PA相似,多为涉及PLAG1和HMGA2基因的融合(表1)。

微分泌腺癌(microsecretory adenocarcinoma,MSA)是根据组织学和免疫表型特征分类的肿瘤,携带MEF2C-SS18融合[59];MEF2D为MEF2C的同族亚型,也可与SS18发生融合并见于急性淋巴细胞白血病[78]。唾液腺微筛状腺癌(microcribriform adenocarcinoma,MCA)的病理表现与MSA相似[59-60]但携带SS18-ZBTB7A融合。目前就唾液腺筛状腺癌(cribriform adenocarcinoma of salivary gland,CASG)构成独立实体还是多形性腺癌(polymorphous adenocarcinoma,PAC)的筛状亚型尚未达成共识,但PRKD1是CASG融合类型中最常涉及的基因,其融合伙伴中的ARID1A与ARID1B同属ARID(AT-rich interaction domain)家族[62-63],该家族中已发现多种乳腺癌生物标志物[79]并与消化道癌免疫浸润和肿瘤微环境相关[80],还是恶性肿瘤免疫治疗的新型生物标志物[81]。PRKD2、PRKD3与PRKD1基因具有相同的结构,当该基因家族发生融合时通常只保留蛋白激酶结构域[62]。

唾液腺良性肿瘤预后较好,对其进行融合基因研究可能有助于唾液腺恶性肿瘤致病机制的探索。FGFR1-PLAG1可能使PA更易于发生MECA谱系的恶性转化,导致该融合在PA恶变的MECA中显著特异性富集[32]。MEC中的CRTC1-MAML2也在沃辛瘤(warthin’s tumor,WT)中检出,该融合可能提供了这两种肿瘤发展共同的分子途径[76]。有研究提出,淋巴基质中携带CRTC1-MAML2融合的导管细胞将引起WT发生,而存在于唾液腺或非淋巴成分时会导致MEC发生[77]。

2 融合基因在唾液腺肿瘤中的作用

融合基因在部分唾液腺肿瘤中已明确作为辅助诊断的生物标志物。MAML2基因分离荧光原位杂交已用于MEC诊断;常规用于诊断AciCC的组织化学和免疫组织化学标志物是非特异性的,而NR4A3可作为一种具有高度特异性(100%)和敏感性(98%)的免疫组织化学诊断标志物[82];ETV6-NTRK3虽见于多种肿瘤,但尚未在SC以外的任何其他唾液腺肿瘤中报告且对SC组织型有高度特异性,因此该融合对SC具有诊断意义;TGFBR3-PLAG1可作为MECA诊断的潜在分子标志物[32]。但需注意融合基因仅起到病理诊断的辅助作用。

除了特征性出现于某些肿瘤类型中,融合基因还具有致癌作用:在体外和异种移植研究中已确定CRTC1-MAML2对MEC细胞生长和存活起关键作用[83],是其发生和维持的主要致癌驱动因素[84];NR4A3和NR4A2过表达是AciCC发展中的致癌驱动因素[85-86];TGFBR3-PLAG1在介导正常唾液腺组织或良性PA恶性转化及TGFBR3蛋白过表达促进MECA发展过程中发挥作用,其过表达可能与MECA内独特的转录程序相关[32]。

此外,融合基因还可能与肿瘤特征及预后相关。携带CRTC1-MAML2的MEC肿瘤普遍较小、多见于年轻个体和低度恶性病变,与较好的预后相关,但是否能作为预测生物学行为的标志物各研究的结果相互矛盾[87-89];而EWSR1-POU5F1似乎在分化程度较差的MEC中更为常见,可能具有预后意义[35]。Ito等[90]认为ETV6-X可能与SC不良的肿瘤特征相关;Skálová等[91]与前者观点相同,认为ETV6-X及ETV6-NTRK3的非典型外显子融合可能与更具浸润性的组织学特征及不良预后相关;ETV6-RET和EGFR-SEPT14双重框内融合均存在于SC中时,两者可能都为致癌驱动因素并可能与囊性组织形态学亚型、临床侵袭性病例的治疗有关[44]。

3 融合基因在唾液腺恶性肿瘤中的致癌作用机制

融合基因主要通过癌基因过表达或嵌合蛋白发挥致癌作用,影响细胞的增殖、迁移、周期调控等,一些分子还可与融合基因起到协同作用。

CRTC1-MAML2是MEC发病过程中的起始事件[84],可反式激活EGFR配体——AREG表达,诱导自分泌AREG-EGFR信号环形成,影响细胞周期调控,进而有利于癌细胞生长和存活[83]。由于CDKN2A(p16)是抑制G1/S细胞周期进展的CDK4/6-RB信号转导的关键调节因子[92-93],且p16缺失的融合阳性MEC患者预后不良[94],失调的p16-CDK4/6-RB信号可能在体内致癌过程中与CRTC1-MAML2起协同作用[84]。在EWSR1-POU5F1中,EWSR1氨基末端结构域与包含DNA结合结构域的POU5F1羧基末端融合,预计该融合蛋白的功能与其他EWSR1融合蛋白类似:其反式激活特性源于EWSR1氨基末端结构域,嵌合蛋白可能通过靶基因特异性失调促进肿瘤发生[35]。

无论MYB-NFIB断点位置如何,均可导致ACC 内MYB过度激活[95],MYBL1-NFIB也可使MYBL1高表达[39];且多数情况下NFIB只保留小部分开放阅读框,作用几乎忽略不计[10]。易位可能使融合转录物和截短的c-Myb或a-Myb蛋白表达[6],这与肿瘤的局部侵袭性有关,并与MYB/MYBL1基因的主要靶标MYC癌基因过度表达存在显著关联[7]。MYB-NFIB融合在体外可使细胞增殖增加及参与细胞周期调控、DNA复制和修复的基因上调[96],但致癌的确切机制仍有待阐明。

t(4;9)(q13;q31)畸变可通过增强子劫持上调NR4A3表达,并作为AciCC中的致癌驱动事件[11,97]。但免疫组化检测的NR4A3表达与其重排的存在并不完全相关,HTN3-MSANTD3也可导致类似的NR4A3核染色[11,82],所以检测AciCC内NR4A3融合不宜采用免疫组化方法。ACC内特征性的MYB基因的编码蛋白可作为NR4A3的辅助因子:NR4A3的配体结合域与MYB的DNA结合域相互作用可增加NR4A3的转录激活活性,两者均过表达的AciCC患者生存率较低[11]。PA中NFIB也可通过增强子劫持和融合基因共同激活PLAG1或HMGA2过表达[69],PLAG1过表达及靶基因失调是PA的关键致癌事件[98];HMGA2-WIF1所致的HMGA2上调与WIF1下调可能存在协同效应且WIF1下调在PA的发生和(或)进展中发挥作用[71]。

CCC的EWSR1-CREM在黑色素瘤细胞系CHL-1内是一种致癌融合,可促进细胞增殖、迁移,并且其致癌特性可能主要通过改变一种名为ODC1(ornithine decarboxylase)的成熟致癌酶的表达水平实现[99],控制或降低其表达可能对携带该融合的肿瘤起到抑制作用。

TGFBR3因组织背景不同发挥抑癌或致癌作用:作为肿瘤抑制因子时,与TGFBR1或TGFBR2结合并负调控TGF-β信号传导,从而抑制TGFBR1/2复合物形成[100];在MECA中,TGFBR3-PLAG1融合可通过TGFBR3过表达使其独立于TGF-β信号传导发挥致癌作用[32],并与PLAG1过表达的致瘤性起协同作用[101-102]。所有携带PLAG1重排的MECA均为PLAG1过表达,其中FGFR1-PLAG1的PLAG1表达水平往往最高;胰岛素样生长因子2可能与MECA中PLAG1融合基因的致癌作用相关[32]。明确融合基因在唾液腺肿瘤中发挥致癌作用的机制并发现可靶向的位点有望研发针对性药物并应用于临床治疗,其余唾液腺肿瘤中特征性融合基因的激活及致病机制仍有待进一步研究。

4 唾液腺恶性肿瘤中针对融合基因的药物治疗

4.1 靶向药类 MEC的CRTC1-MAML2诱导AREG-EGFR信号异常激活,抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)可抑制EGFR信号转导进而阻断肿瘤生长[83];EGFR抑制剂——厄洛替尼和靶向异常p16-CDK4/6信号激活的CDK4/6抑制剂——帕博西尼联合应用亦可有效阻断肿瘤生长[84];针对EGFR突变非小细胞肺癌的酪氨酸激酶抑制剂——吉非替尼,可同时抑制MEC中多个关键信号的蛋白磷酸化,与其他针对该融合的抑制剂联合使用可能会更有效[103]。

如拉罗替尼、恩曲替尼的酪氨酸激酶抑制剂可使大多数ETV6-NTRK3融合阳性SC患者获得显着而持久的反应,但存在突变相关的获得性耐药[104];在非NTRK3融合的患者中,识别ETV6的融合伴侣对靶向治疗至关重要,并可能有助于晚期患者的治疗管理。对于ETV6-RET、EGFR-SEPT14双融合的患者,同时针对两种融合治疗可能具有临床实用性[44]。

另外,SC、IC、MECA中还具有激活的MET、RET、ALK融合(表1),针对这部分患者可考虑使用相应融合基因的靶向药物。NR4A3是AciCC中最常见的驱动癌基因,可将其作为治疗的新靶点。

4.2 其他 抑制MYB表达是ACC靶向治疗有前景的途径之一,基于这一理论的研究已取得有希望的结果:全反式维甲酸在逆转疾病进展方面虽没达到预期效果,但是一种安全有效的疾病稳定治疗方法[105];莫能菌素可抑制ACC细胞活力和非贴壁生长并为最有希望深入研究的药物[106];蛋白酶体抑制剂oprozomib在纳摩尔浓度下可成功抑制ACC原代细胞生长、诱导细胞凋亡并损害球体形成能力[107];DNA损伤传感器激酶ATR是MYB基因和MYB-NFIB融合的下游效应器,并有望成为ACC新的治疗靶点[96]。

可针对融合基因的靶向药物已上市且有较好的临床获益,但仍存在携带特征性融合基因的唾液腺肿瘤尚未研发出相应的药物可供无法手术、复发、转移的患者治疗使用,针对该类唾液腺肿瘤患者适用的靶向药物研究十分紧要。

5 展望

融合基因可为唾液腺肿瘤患者的精细诊断提供分子生物标志物,如MEC的CRTC1/3-MAML2、ACC的MYB/MYBL1-NFIB、SC的ETV6-NTRK3、CCC的EWSR1-ATF1等,不仅有助于病理表现相似时的诊断,使患者得到适宜的治疗,还有利于将患者根据亚型及系统分层纳入研究,如MSA和MCA因特征性融合基因及病理表现将以前只能归为非特异性腺癌的肿瘤重新分型,从而降低唾液腺肿瘤研究的复杂性、推进临床试验及治疗研究。另外,如IC不同亚型的分子特征各不相同,对不同肿瘤及其亚型进行分子分析可能有助于进一步分型或确立新的亚型实现精细诊断。除了作为诊断标志物,融合基因还与病理表现相关并有望作为预后标志物:CRTC1-MAML2阳性的MEC 预后较好,而EWSR1-POU5F1多见于分化较差的肿瘤。因此,将融合基因与临床病理特征结合也可能具有重要意义。

检测融合基因时应注意因断点位置不同而存在多种融合转录变体,如ACC内MYB-NFIB的断点可位于MYB基因第8-15外显子、NFIB基因第8-12外显子或3’非翻译区,此时需采取适当的检测方法进行融合鉴定[9]。各项研究中用于检测融合基因的标本大多来源于原发肿瘤,与复发/转移标本的基因组景观可能存在差异,ACC即存在多种因素促进肿瘤进展、影响患者最终治疗结果[108]。未来研究中评估该类恶性程度较高的肿瘤不同疾病部位间的异质性可能有新的发现。

各型唾液腺肿瘤中检出的融合基因可能存在重叠,首先提示其组织来源、发生方式或临床病理表现存在相似性,要注意鉴别诊断,如EWSR1-ATF1既存在于CCC还见于透明细胞MECA、CRTC1-MAML2可因组织背景不同而演化为MEC或WT;其次,对属于同一基因家族的成员检测有助于发现新融合伙伴、提供替代治疗靶点,如MEC的CRTC1/CRTC3-MAML2、ACC的MYB/MYBL1-NFIB、CCC的EWSR1-ATF1/CREB1/CREM等;最后,以某一融合基因定义的肿瘤在未来的研究中应注意扩展融合基因分子谱并重新定义该肿瘤,如SC以ETV6-NTRK3为特征后陆续发现更多类型的融合,对其特征性融合分子谱应重新定义;反观新分类的MSA、MCA及分类尚未得出结论的CASG,以融合基因定义该类肿瘤时应持保守态度,未来需要更多病例详细阐明其组织学、免疫组织化学、分子和行为特征。若异种肿瘤具有同种融合基因、致癌机制存在共同点且一方已有靶向药物,则可扩大另一癌种患者的治疗选择:CCC虽发生率低,但其特征性融合见于多种肿瘤类型,用于EWSR1-ATF1融合阳性透明细胞癌肉瘤的c-Met抑制剂[109]、组蛋白去乙酰化酶抑制剂伏立诺他[110-111]和处于临床实验阶段的PRMT5抑制剂JNJ-64619178[112]也可考虑用于唾液腺CCC患者,但需注意肿瘤的异质性及机制的差异性可能导致靶点不同而影响治疗效果。

染色体重排除了可以形成融合基因外,作为基因调控元件之一的增强子也可通过染色体重排并置于癌基因附近并介导其过表达,这一现象称为增强子劫持。AciCC的NR4A3[97]、PA的PLAG1和HMGA2[69]均可能通过增强子劫持与融合基因协同作用使基因表达激活增加,发掘更多的融合基因、增强子劫持及下游信号传导等机制有助于深入了解肿瘤的发生发展过程,并发现新的靶点。将融合基因与基因层面的分子改变结合分析,也可对肿瘤的特征获得更深刻的了解:顶浆分泌型和嗜酸型IC的突变特点使其同时具备基因融合和基因突变特征;NTRK融合阳性的肿瘤同时存在基因突变时可使其获得耐药性[104],发现突变位点、改善药物结构及作用机制才能使患者临床获益。融合基因还可能与免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)治疗相关:Yang等[113]已证实基因融合是免疫原性新抗原的来源,可以介导对免疫治疗的反应。将融合基因或其相应的靶向药物与ICIs治疗结合有极大的探索空间。

在唾液腺恶性肿瘤中检出的融合基因除了有利于唾液腺肿瘤的鉴别诊断,更有利于无法手术、复发和转移患者获得靶向治疗的机会并取得临床获益,对该类融合基因的靶向药物研发十分必要。本文将发现于典型唾液腺肿瘤的融合基因进行横向比较研究,并结合它们在临床上的诊断治疗作用进行了总结和亟需探索的方向,以期融合基因在唾液腺肿瘤中的研究更加深入并益于临床治疗。