理气补血汤对失神经胫骨骨折愈合的影响*

陈一仁 张燕 刘俊宁 牛素生 杜梦凡 陈灿 胡斌涵 黄茂畅赵宇

随着工业和交通等行业的发展，骨折伴周围神经损伤的发生率明显增加。周围神经对于维持骨骼内稳态和骨折愈合至关重要[1-2]，骨折端失神经支配后，因神经肽类物质缺少，导致成骨细胞活性降低，破骨细胞活性增加，肌肉萎缩等情况，骨折将发生延迟愈合甚至不愈合[3-4]，成为临床治疗的难点。虽然目前临床神经损伤修复技术取得了长足进步，但由于神经再生速度缓慢，约为1 mm/d[5]，使得即使做了神经修复，骨折端仍有很长时间处于无神经支配状态，使骨折愈合受到严重影响[6]，因此改善此段时间内骨折端骨痂质量，对提高失神经骨折的临床治疗效果具有非常重要的意义。

理气补血汤是福建省名中医王和鸣教授整理的南少林骨伤经验方，具有理气活血、益气补血、补肝肾、强筋骨之效，临床主要用于治疗骨折延迟愈合[7]。有研究发现理气补血汤可显著延缓失神经骨骼萎缩[8-9]。本研究采用切断SD 大鼠右侧坐骨神经加右侧胫骨骨折克氏针内固定的方法建立失神经骨折模型，探讨理气补血汤对坐骨神经损伤后胫骨骨折愈合的影响，为临床治疗伴周围神经损伤的骨折提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与药物制备

1.1.1 实验动物 2022 年8 月—2023 年8 月选择SPF 级3 月龄雄性SD 大鼠27 只，体重160～180 g，由北京华阜康生物科技股份公司提供，合格证号：SCXK（京）2019-008。按随机数字表法分为A、B、C 三组，每组9 只。A 组：单纯胫骨骨折内固定+生理盐水，B 组：坐骨神经切断+骨折内固定+生理盐水，C 组：坐骨神经切断+骨折内固定+理气补血汤。实验动物处理方法经福建中医药大学动物伦理委员会审核通过，伦理号：2022134。

1.1.2 主要仪器与试剂 中药旋蒸仪（上海亚荣生化仪器厂，RE2000 mA）、石蜡包埋机（湖北锦源医疗科技有限公司，JY-BMC）、病理切片机（美国Thermo 公司，HM-325）、生物显微镜（德国徕卡微系统有限公司，DM2700P）、小动物X 光机（美国KUBTEC 公司，XRAY-Imaging）、乌拉坦（上海源叶生物科技有限公司，MFCD00007966）、伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司，G1080）、苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司，G1100）、马松三色染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，G1340）、大鼠Ⅰ型胶原C 端肽（CTX-Ⅰ）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美，CSB-E12776r）、大鼠Ⅰ型前胶原N 端前肽（PⅠNP）ELISA 试剂盒（武汉华美，CSB-E12774r）、大鼠骨碱性磷酸酶（BALP）ELISA 试剂盒（武汉华美，CSBE11865r）、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）ELISA 试剂盒（武汉华美，CSB-E08491r）

1.1.3 药物制备 理气补血汤（黄芪、太子参、制首乌、当归、白芍、续断、骨碎补各9 g，川芎6 g，炙甘草3 g），由福建中医药大学耗材平台提供，按常规方法煎煮，旋转蒸发仪将其浓缩为2 g/mL 理气补血汤水煎液，置4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 大鼠适应性饲养1 周后，使用乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠。

A 组造模方法：麻醉成功后大鼠取仰卧位，剃除右膝及小腿毛发，消毒，铺无菌洞巾。稍屈曲膝关节，胫骨内侧平台紧贴髌韧带，以20 mL 注射器针头开口，沿胫骨长轴方向将直径0.8 mm 的克氏针穿入胫骨骨髓腔，于胫骨内侧中上1/3 处纵向切口约1 cm，暴露胫骨。将插入骨髓腔的克氏针缓慢退出约2/3，用直径为2 cm 的电动锯片（厚度为0.1 mm）沿胫骨上1/3 处垂直纵轴切割（5 000 r/min，切割时为防止骨骼灼伤，用生理盐水不停滴切割处），当胫骨横断2/3 时，组织钳掰断胫骨剩余处，然后将克氏针经过骨折处，重新插入骨髓腔内。确认断端位置良好后，牢固固定。生理盐水冲洗伤口，缝合肌肉和皮肤。

B 组、C 组造模方法：麻醉后剃除右臀区、股后区及胫骨处毛发，先取俯卧位，消毒，铺无菌巾，取股后外侧切口，依次切开皮肤和筋膜，自臀浅肌与股二头肌之间的肌间隙分离，暴露坐骨神经，于股骨中上1/3 交界处切除1 cm 坐骨神经，将坐骨神经近端其反折缝于肌肉处，逐层缝合伤口。大鼠改仰卧位，进行胫骨骨折克氏针内固定，具体操作方法同A 组

1.2.2 干预方法 A 组、B 组予以0.9%生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃，C 组予以理气补血汤灌胃。灌胃剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算。术后第1 天予以灌胃，根据动物体重，每周调整灌胃剂量。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 X 线检查 干预28 d 后麻醉大鼠，取俯卧位，右下肢髋、膝关节屈曲90°，脚尖冲外，拍摄右侧胫骨侧位片，由2 名读片经验丰富的观察者按照Lane-Sandhu 评分标准[10]进行评分。Lane-Sandhu评分标准见表1。

表1 Lane-Sandhu X线评分标准

1.3.2 ELISA 检测 拍摄X 线片后，采用腹主动脉取血方式取动脉血，室温下静置2 h，离心机以3 000 r/min，离心15 min 后，抽取上清液，-80 ℃保存，ELISA 检测血清BALP、PⅠNP、CTX-Ⅰ、TRACP-5b。1.3.3 苏木素伊红（HE）及马松染色 取血后，离断右膝及右踝关节，剥离胫骨周围附着的肌肉，保留骨膜和骨痂完整，取出克氏针，多聚甲醛固定48 h，10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙，脱钙后保留骨折线上下5 mm，HE 染色观察骨折端骨痂生成情况；马松染色观察胶原分布排列情况。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS 25.0 统计软件进行分析处理，所有计量资料用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，样本均数间的两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组X 线检查结果

干预28 d 后，胫骨侧位片显示骨折线均位于右胫骨中上1/3 左右处，骨折对线、对位良好，均获得解剖复位。A 组骨折处骨痂基本大部分已吸收，骨折线模糊，骨痂基本塑形完毕，见图1A；B 组骨折处骨折线部分模糊，骨痂呈梭形膨大，有连续性骨痂通过骨折线，骨痂重塑未完成，见图1B；C 组骨折处骨折线模糊，少量骨痂存留，见图1C。Lane-Sandhu 评分结果：A 组为（8.33±0.88）分，B 组为（5.00±0.76）分，C 组为（8.17±0.73）分，B 组明显低于A 组、C 组，差异均有统计学意义（P＜0.05），C 组评分虽较A 组低，但两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 三组大鼠胫骨侧位X线检查结果

2.2 三组HE 染色结果

干预28 d 后，A 组骨痂成熟明显高于B 组、C 组，C 组较B 组成熟度好。A 组骨痂HE 染色可见软骨细胞数量较少，已转化为编织骨，骨髓腔部分贯通，呈有序排列，骨小梁体积较大，沿应力方向排列，见图2A；B 组中可观察到大量软骨细胞，骨化重建不够，骨小梁排列紊乱，可见骨吸收产生的较大空腔，见图2B；C 组仍可见少量软骨细胞，大部分已转化为编织骨，骨髓腔部分贯通，见图2C。

图2 三组大鼠胫骨骨痂HE染色结果（100×）

2.3 三组马松染色结果

干预28 d 后，马松染色A 组可观察到大量钙化骨痂，钙化骨痂与周围骨骼相融，胶原纤维基本已被吸收，少量胶原纤维散在分布于钙化骨痂周围，见图3A；B 组可见骨痂外部有大量软骨细胞，胶原纤维部分被吸收，分布于软骨细胞周围，见图3B；C 组观察到软骨细胞数量较B 组数量少，胶原纤维未被完成吸收，骨痂外部的骨痂基本已经钙化，见图3C。

图3 三组大鼠胫骨骨痂Masson染色图结果（100×）

2.4 三组ELISA 检测结果

干预28 d 后A 组血清中BALP、PⅠNP 均高于B 组、C 组，C 组BALP、PⅠNP 均高于B 组；A 组CTX-Ⅰ、TRACP-5b 均低于B 组、C 组， 而C 组CTX-Ⅰ、TRACP-5b 均低于B 组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 三组ELISA检测结果（±s）

表2 三组ELISA检测结果（±s）

*与A 组比较，P＜0.05；#与B 组比较，P＜0.05。

组别BALP（U/L）PⅠNP（pg/mL）CTX-Ⅰ（pg/mL）TRACP-5b（mIU/mL）A 组（n=9）45.70±0.94487.97±10.0152.85±1.613.18±0.61 B 组（n=9） 29.92±0.29* 343.00±14.03* 73.56±0.93* 5.39±0.13*C 组（n=9） 36.67±0.22*# 418.32±22.64*# 63.62±3.61*# 4.62±0.11*#F 值183.7819.4819.53113.72 P 值0.000.000.000.00

3 讨论

周围神经对于维持骨骼内稳态和骨折愈合至关重要[11]，其通过分泌神经肽类物质如降钙素基因相关肽（CGRP）、神经肽（SP）、血管活性肽（VIP）等，调控成骨细胞活性、破骨细胞数量，影响骨骼稳态和骨折愈合[12]；通过调节肌容量及肌肉收缩对骨折端产生力学刺激等[13-14]，促进骨折愈合。当骨折端失神经支配后，在愈合过程中因神经肽类物质缺少，成骨细胞活性下降，破骨细胞活性增加，肌肉萎缩缺乏力学刺激等因素，导致骨折延迟愈合甚至不愈合。

夏群等[15]证实，失神经支配胫骨破骨细胞指数及破骨细胞吸收表面远大于正常神经支配组，在形成大量骨痂的同时，骨吸收较多，骨痂排列杂乱。马昕等[16]发现周围神经切断后股骨骨折大鼠术后4 周X 线显示其骨痂较单纯股骨干骨折组多，组织学显示周围神经切断组骨痂量虽然多，但其中类骨质较多，骨钙的沉积相对较少，而且骨痂缺乏血管和正常的骨小梁结构，骨重建不够理想。

针对失神经骨折的治疗，需要考虑神经修复和骨折修复两个方面。虽然随着显微外科技术的进步，神经损伤修复技术包括神经吻合术、自体神经移植、神经移植物等多种方法能较好地恢复受损神经的连续性[17-19]，但由于神经的再生速度缓慢，骨折端仍有很长时间处于无神经支配状态，严重影响了骨折愈合质量。因此改善此段时间内骨折端骨痂质量，延缓肌肉萎缩，为神经的再支配争取宝贵的治疗时间，这将对提高失神经骨折的临床治疗效果具有非常重要的意义。

理气补血汤由黄芪、太子参、当归、白芍、制首乌、川芎、续断、骨碎补、炙甘草组成，具有理气活血、益气补血、补肝肾、强筋骨之效。在张安桢等[7]研究中以理气补血汤治疗骨折延迟愈合43 例，43 例全部获得临床愈合，除3 例股骨颈骨折畸形愈合，其余功能恢复均较满意。前期实验研究中发现理气补血汤能显著减缓肌动蛋白、肌球蛋白表达的下降[8]，显著抑制失神经支配骨骼肌胶原纤维的形成[20-21]，从而延缓了肌肉萎缩，还能促进周围神经损伤的修复[22]。在此基础上，本研究进一步观察了理气补血汤对坐骨神经损伤后胫骨骨折愈合的影响。

本研究通过横断大鼠胫骨，克氏针内固定骨折断端形成了大鼠胫骨骨折模型。克氏针不能完全控制骨折端的旋转移位，因此该骨折模型的愈合属于二期愈合，更符合临床常见骨折愈合过程。实验结果显示干预28 d 后，坐骨神经切断加胫骨骨折组（B 组）的骨折线部分模糊，骨痂呈梭形膨大，而坐骨神经完整仅胫骨骨折组（A 组）的骨痂塑形基本完毕，其结果与丁云等[23]研究结果一致，说明坐骨神经损伤明显影响了骨折愈合过程。理气补血汤干预后的C 组，虽还有少量骨痂存留，但骨折线基本模糊，Lane-Sandhu 评分明显高于B 组，与A 组评分无明显差异；HE 染色、马松染色显示理气补血汤干预后可使坐骨神经损伤后的胫骨骨折处的软骨向骨痂转化、骨痂成熟度得到提升，说明理气补血汤可明显改善坐骨神经损伤后的胫骨骨折愈合质量。

PⅠNP 反映成骨细胞合成骨胶原的能力，用于监测成骨细胞活力，可作为预测骨折愈合的影响因子之一[24]；BALP 由成骨细胞分泌，是反映成骨细胞活性的标志物，在矿化过程中可水解无机磷酸盐，有益于类骨质的矿化，类骨质在成骨细胞的作用下矿化形成骨质，则骨痂进一步成熟，力学强度提升[25-26]；TRACP-5b 主要来源于破骨细胞，参与降解骨基质中钙磷矿化物，是破骨细胞活性和骨吸收状态的临床标志物[27]；CTX-Ⅰ也是反映骨吸收的标志，主要反映Ⅰ型胶原的降解，Ⅰ型胶原是类骨质的主要物质基础[28]，其占比对骨折的修复和力学强度影响较大。

本研究结果显示单纯胫骨骨折的A 组BALP和PⅠNP 均明显高于合并坐骨神经损伤的B 组（P＜0.05），主要与周围神经损伤后CGRP 和SP 分泌下降，成骨作用减弱有关[29-30]。而理气补血汤干预后的C 组血清中BALP 和PⅠNP 含量均明显高于B 组（P＜0.05），说明理气补血汤干预后骨折端的成骨反应增强。同时坐骨神经损伤后B 组的CTX-Ⅰ和TRACP-5b 的表达均明显高于无坐骨神经损伤单纯胫骨骨折的A 组（P＜0.05），印证了失神经后破骨细胞活性增加，骨吸收增多，这与张贵春[31]的结论一致，而理气补血汤干预的C 组其CTX-Ⅰ和TRACP-5b 的含量均明显低于B 组（P＜0.05），说明理气补血汤干预后骨痂质量的改善与抑制破骨细胞活性和骨质过度吸收有关。

综上所述，理气补血汤可改善坐骨神经损伤后胫骨骨折愈合质量，其机制可能与调控破骨和成骨过程，促进骨痂成熟，调节骨痂重塑有关，但其具体作用机制及其对骨痂力学性能的影响，需进一步研究明确。