基于网络药理学对鹿茸抗骨质疏松症的作用机制研究

李春楠，申嘉明，吕经纬，张楠茜，张辉，孙佳明

（长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117）

随着全球老年人口的逐年增多，骨质疏松症（Osteoporosis,OP）发病率居高不下，OP 成为严重危害人类身体健康和影响生活质量的疾病之一，在世界常见病的发病率排行中位列第7 位[1]，是世界性公共卫生问题[2]。OP 是一种由于骨量丢失或降低、骨组织微结构破坏、骨脆性增加及骨密度下降，容易引起骨折的全身代谢性骨病[3]，中老年人和绝经后妇女尤为常见[4]。虽然OP 多数情况下不会直接导致死亡，但严重影响了患者的生活能力和生活质量，为社会医疗增加负担。当前，OP发病机制的研究主要集中在细胞分化与凋亡、成骨、破骨细胞影响和基因多态性等方面，治疗OP 的药物主要分为3 大类：骨吸收抑制药、骨形成促进药和骨矿化促进药，常用的西药副作用较多，长期使用会增加患乳腺癌、冠心病等疾病的风险[5]。因此，研究人员将目光投向了中医药，去寻找高效、低毒治疗OP的药物[6-9]。

鹿茸是上等的滋补保健品，我国拥有悠久的鹿产品食用历史[10]。鹿茸作为名贵的中药材，民间常用其泡酒来饮用以强身健体。经国家市场监督管理总局网站中特殊食品信息查询平台，检索到含有鹿茸的保健食品有200 多种，主要以缓解体力疲劳和增强免疫力为主，此外，鹿茸与其他中药配伍形成了新的保健作用，如抗疲劳保健食品人参红景天鹿茸保健酒，改善睡眠的口服液等[11]。鹿茸在《本草纲目》记载：“生精补髓，养血益阳，强筋健骨”，即有补肾阳，益精血，强筋骨的作用，常用于阳痿滑精、宫冷不孕、神疲、崩漏带下、阴疽不敛等，有广泛的药理作用。《素问·宣明五气》记载：“肾主骨”；《素问·痿论》记载：“肾主身之骨髓”，“肾藏精，精能生髓，髓能充骨”，说明了肾与骨的关系非常密切。鹿茸入肾经，因此，鹿茸具备抗OP 作用，兼具一定药用功效和营养价值。

为了进一步探讨鹿茸抗OP 作用机制，本研究采用网络药理学与分子对接技术结合成骨细胞的验证方法，挖掘鹿茸潜在有效成分和作用靶点，阐明基因本体功能及信号通路，为鹿茸抗OP 研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂与仪器

鹿茸切片购于吉林省双阳梅花鹿厂；小鼠成骨细胞（MC3T3-E1）购自于中国科学院上海细胞生物学研究所；MEM细胞培养液、双抗购自美国HYCLONE公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）购自于北京博奥森；地塞米松、DAPI 染色液购自于索莱宝公司，SYBR Premix 反转录试剂盒Ⅱ、Probe qPCR Mix等购自于长春百金生物科技有限公司。

GZLY-0.4 真空冷冻干燥机（北京速原中天科技有限公司）；BIO-RAD-680 全自动酶标仪（美国伯乐公司）；LineGene 9600 q-PCR仪（杭州博日科技）；CKX41 倒置显微镜（日本奥林巴斯）。

1.2 化学成分收集和筛选与靶点预测

由于鹿茸是非植物药，检索BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库设置阈值分数（core）≥30 和P 值（P-value）≤0.05 筛选鹿茸成分；利用中国知网、Web of Science 等数据库检索日期2005年1 月1 日至2021 年7 月1 日，采用主题词与自由词结合的方式，中文检索式为“鹿茸”和“化学成分”；英文检索式为“pilose antler”and“chemical composition”研究文献限定为核心期刊来源，筛除非动物药鹿茸文献，纳入鹿茸化学成分相关的文献；收集、归纳和整理文献中的鹿茸化学成分。

将检索成分在美国国立生物技术信息中心（NCBI，https://w-ww.ncbi.nlm.nih.gov/）查询相应SMILES 号，应用BATMAN-TCM、Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、SEA（http://sea.bkslab.org/）等数据库进行靶点预测，最后将所有预测的靶点合并，整理查重，确定鹿茸中成分作用靶点。

1.3 疾病相关靶点收集

采用TTD（https://db.idrbl-ab.org/ttd/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Drugbank 等数据库，检索“Osteoporosis”，收集整理和查重相关的靶点。

1.4 鹿茸治疗OP的核心靶点筛选

将前期检索的化学成分预测靶点、疾病靶点导入Unipro（thttps://www.uni-prot.org/）中，考察范围定位到人类，最后转化成对应的Uniprot ID、基因名称。以Uniprot 号为桥梁，将复方中所有成分预测靶点与疾病对应靶点进行合并，查找重复项。通过Image GP 平台（http://www.ehbio.com/ImageGP/）将上述中药活性成分靶点与OP 相关靶点映射，绘制韦恩图，交集即为鹿茸治疗OP 潜在核心靶点。

1.5 GO功能分析与KEGG通路富集

通过Cytoscape 3.7.1 软件中的Clue Go 插件对核心靶点进行GO 功能进行富集分析（P≤0.01），分析药物作用靶点的PPI 及生物学过程，阐明靶点蛋白在基因功能中的主要作用。另外，将筛选的核心靶点导入Metascape 数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），选择KEGG 通路，物种设置为人，通路富集分析，阐明核心靶点在信号通路中的作用，得到抗骨质疏松症主要作用通路及对应靶点。

1.6 构建“中药成分疾病靶点通路”网络图

将鹿茸、疾病、活性成分、核心靶点、KEGG 通路数据导入Cytoscape 3.7.1 软件中，以五者为节点，点击Merge 功能，相互关系分别用边相连，构建“中药成分—疾病靶点—通路”网络图，进行拓扑参数分析，P-value 值作为考察分析主要节点，确定主要成分、靶点与KEGG 通路。

1.7 分子对接计算与绘图

应用AutoDock 4.2.6 软件将拓扑参数靠前的化学成分作为配体，与拓扑参数靠前的靶点作为受体进行分子对接，计算结合能。受体结构从蛋白数据库中得到（PDB http://www.rcsb.org/pdb），应用ChemBio3D Ultra（Cambridge soft Corp，Waltham，MA，USA）进行配体的三维结构转换使用，采用PyMOL 软件查看分子对接复合体的3D 空间构象。

1.8 体外细胞验证

1.8.1 鹿茸组分的制备 取鹿茸10 g，加10 倍量的水，粉碎，4 ℃浸提24 h 后闪提3 次，离心取上清，选用3 kDa 的Millipore 超滤膜对提取液进行超滤，收集不同质量范围的溶液，冻干，得到鹿茸＜3 kDa 组分[12]。

1.8.2 MC3T3-E1 细胞存活率的测定 CCK8 法测定细胞存活率，以每孔1×104个细胞接种于96 孔板，随机分为空白组、模型组和给药组，培养24 h，细胞模型组和给药组加入100mol/L 地塞米松造模24 h后，分别加入浓度为25g/mL、50g/mL、100g/mL、200g/mL 和300g/mL 样品，每组5 个复孔，在培养箱中继续培养24 h后，每孔加入10L CCK8 试剂，37 ℃避光孵育1 h，在酶标仪450 nm 处检测各组OD值。根据所测得吸光度，计算每组细胞存活率。

细胞荧光显色观察，MC3T3-E1 细胞在6 孔培养板中孵育，随机分为空白组、模型组和给药组，用100mol/L 地塞米松造模24 h 后，药物分别加入50g/mL、100g/mL、200g/mL，继续培养24 h。样品处理后进行DAPI 染色，每孔加入10L 细胞染色液DAPI，25 ℃孵育10 min，PBS 洗涤若干次，荧光显微镜观察细胞形态[13]。

1.8.3 MC3T3-E1 细胞SRC、IL6 和TNFmRNA 表达测定 提取细胞总RNA，检测RNA 浓度后，以1g总RNA 根据反转录试剂盒说明书方法操作，将反转录体系稀释10 倍后进行Real-time PCR 反应，检测SRC、IL-6、TNF 基因的表达影响，以GAPDH 作为内参，最后表达水平的差异倍数用2-Ct方法分析；引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，SRC 上引物序列（5'-3'）：GAACCCGAGAGGGACCTTC,下引物序列（5'-3'）：GAGGCAGTAGGCACCTTTTGT；IL-6 上引物序列（5'-3'）：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG，下引物序列（5'-3'）：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；TNF 上引物序列（5'-3'）：CAGGCGGTGCCTATGTCTC，下引物序列（5'-3'）：CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG。

1.8.4 数理统计 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量结果以均值±标准差（）表示，多组之间采用单因素方差分析（One-way ANOVA），柱形图由GraphPad Prism 5.0 软件生成，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 鹿茸化学成分信息

检索BATMAN-TCM 数据库共有14 种鹿茸化合物，结合相关文献，整理后确定了58 种化合物，包括氨基酸、肽类、核苷酸、激素类和生长因子等，见表1。

表1 检索的鹿茸化学成分主要信息Table 1 Main information of chemical constituents of pilose antler retrieved

2.2 鹿茸抗OP的核心靶点确定

成分经数据库预测对应靶点，整理和查重后共有1 331 个靶点；数据库检索疾病靶点，整理后共得到121个疾病靶点。将鹿茸成分预测靶点与疾病靶点交集，整理确定其核心靶点为33 个，见图1；登陆DisGeNET 网站，输入Uniprot 确定其蛋白归属，核心靶点，见表2。

图1 鹿茸和OP 交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of intersection target of pilose antler and OP

表2 鹿茸治疗OP 疾病的核心靶点信息Table 2 Core target information of pilose antler in treating OP disease

2.3 GO功能富集分析

核心靶点进行GO 分析，得到流体剪切应力的细胞反应（Cellular response to fluid shear stress）、一氧化氮生物合成过程的正向调节（Positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、单加氧酶活性的调节（Regulation of monooxygenase activity）和药物跨膜转运（Drug transmembrane transport）等4 大类生物学过程，流体剪切应力是可以促进类成骨细胞向成骨方向进一步分化且与Cbfa1/Runx2 的表达相关联的过程；生物过程主要富集在维生素D生物合成过程（Vitamin D biosynthetic process）、三磷酸腺苷水解偶联阴离子跨膜转运（ATP hydrolysis coupled anion transmembrane transport）等生物过程，见图2 和图3。

图2 GO 功能分析饼状图Fig.2 Pie chart of GO functional analysis

图3 GO 功能分析具体分类图Fig.3 Specific classification diagram of GO functional analysis

通过ClueGO 功能分析生物学过程互作网络，可发现生物过程之间的相互作用关系。图4 显示了4 大类不同生物过程的相互作用，不同颜色代表不同生物过程，其中流体剪切应力的细胞反应（Cellular response to fluid shear stress）生物过程颜色最深，节点也较多，节点的大小代表调控的强弱，节点间的连线代表相互作用，可见骨吸收的调节（Regulation of bone resorption）、组织重塑调节（Regulation of tissue remodeling）和骨吸收（Bone resorption）等生物过程相互作用密切。

图4 生物学过程互作关系网络图Fig.4 Network diagram of biological process interaction relationship

2.4 KEGG通路分析

通过核心靶点的KEGG 分析，得到胆汁分泌通路（Bile secretion）、类固醇激素生物合成通路（Steroid hormonebiosynthesis）和雌激素信号通路（Estrogensignaling pathway）等7 大类通路，见图5。另外，核心靶点主要富集在ABC 转运蛋白（ABC transporters）、催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）和内分泌抵抗通路（Endocrineresistance）等41 条KEGG通路及其对应的靶点。

图5 KEGG 信号通路图Fig.5 KEGG signal path diagram

2.5 构建“中药—成分—疾病靶点—通路”网络图

图6 “鹿茸活性成分疾病靶点通路”治疗OP 网络图Fig.6 OP network diagram of"velvet antleractive ingredientdisease targetpathway treatment"

2.6 鹿茸成分与靶点的分子对接验证

图7 分子对接3D 图Fig.7 3D diagram of molecular docking

表3 分子对接受体蛋白信息Table 3 Information related to molecular docking receptor protein

表4 关键成分与核心靶点分子对接结果Table 4 Docking results of components and target molecules

2.7 细胞试验验证

2.7.1 鹿茸提取物对MC3T3-E1 细胞存活率影响不同浓度的鹿茸提取物对MC3T3-E1 细胞存活率的影响，见图8。地塞米松诱导细胞的模型组与空白组相比，细胞存活率极显著下降（P＜0.01），表明模型造模成功。与模型组相比，给药组在25～300g/mL 质量浓度范围内均不同程度地促进MC3T3-E1 细胞增殖，且呈现浓度依赖性，在300g/mL 质量浓度下促进作用最强，存活率达80.37%，与模型组有极显著差异（P＜0.01）。

图8 鹿茸提取物对MC3T3-E1 细胞存活率影响Fig.8 Effect of pilose antler extract on survival rate of MC3T3-E1 cells

显微镜下观察发现（图9 A），空白组的细胞存活率最高，状态较好；模型组细胞数量明显减少，细胞出现了皱缩、不规则现象，细胞数量少；给药后与模型组相比细胞数量明显增多，且细胞状态较好，表明鹿茸的提取物对地塞米松诱导的MC3T3-E1 模型有促进增殖作用。DAPI染色后，模型组存活细胞荧光显色不强，与空白组相比明显数量减少，给药组细胞数量逐渐增多（图9 B）。

图9 鹿茸提取物对MC3T3-E1 细胞的存活率影响（200）Fig.9 Micrograph of the effect of pilose antler extract on survival rate of MC3T3-E1 cells (200)

2.7.2 鹿茸对核心靶点SRC、IL-6 和TNF 的mRNA表达水平影响 如图10 所示，与空白组相比，地塞米松造模组基因表达明显升高，基因表达出现了明显异常，但在鹿茸提取物给药影响下，SRC、IL-6 和TNF基因表达水平下降，几乎都恢复了基因正常表达水平，通过q-PCR 进一步验证了鹿茸对SRC、IL-6 和TNF 核心靶点的调控作用，与模型组相比均具有抑制作用，利于骨形成。

图10 鹿茸提取物对核心靶点的mRNA 表达水平的影响（，n=3）Fig.10 Effect of pilose antler extract on mRNA expression of core targets (,n=3)

3 讨论

随着OP 患病人群的增多，特别是老年人和绝经妇女[24]，治疗OP 的药物需求量很大。天然产物治疗OP不仅疗效高[25]，且比西药副作用少，深受患者青睐。鹿茸是名贵的中药，《中药大辞典》中曾记载鹿茸“壮元阳、补气血、益精髓、强筋骨”，可见，鹿茸是补肾健骨之良药。

由于检索数据库中鹿茸成分较少，因此，本研究结合文献检索的方法，共查找到鹿茸中58 种成分，核心靶点对应成分36 个，经网络拓扑参数分析发现，其主要发挥治疗OP 的成分为17--雌二醇、前列腺素E1、维生素a 醇、雌酮、胆固醇、睾酮和孕酮等。雌二醇可通过Wnt/-catenin 信号通路作用于骨成型蛋白-2，增加去卵巢OP 大鼠骨密度，改善骨组织结构，进而发挥抗OP 作用[26]；前列腺素E1 可促进成骨细胞和破骨细胞抑制因子的表达，增加OPG mRNA 水平[27]；雌酮和孕酮等成分更是直接引起OP 的主要因素，特别是绝经后妇女的雌激素降低容易导致骨量大量丢失[28]，雌激素通过激活Wnt/-catenin 信号通路途径进而影响BMP2 表达，诱导成骨细胞增殖和分化，抑制凋亡，并调节和促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，提高骨密度，促进新骨形成[29]；孕酮可诱导人成骨细胞和人成骨样细胞TGF-1 和TGF-2 mRNA 表达及蛋白质分泌；雄激素也是促进骨形成和抑制骨吸收来维持骨量和调节骨代谢的重要因素[30]。

另外，SRC、IL-6、TNF、PTGS2 和CA2 的Degree值较高，表明它们是核心关键靶点，在鹿茸治疗OP过程中参与较多。SRC 是由许多细胞外信号分子激活的非受体蛋白酪氨酸激酶，参与细胞代谢过程，SRC 可通过调控ER活性促进人成骨细胞的增殖分化，促进骨形成过程，目前，已将SRC蛋白抑制剂作为治疗OP的一个重要研究方向[31]。IL-6 和TNF 均参与了病理性骨丢失的发生发展过程。汤雁利等[32]研究发现，IL-6、IL-1和TNF-水平与大鼠椎体骨密度、椎间盘骨密度以及小关节骨密度均呈明显负相关，IL-6 能激活IL-1、PGE2 等信号表达，升高RANKL 抑制OPG表达，从而促进骨吸收[33]；而通过抑制TNF-诱导的成骨细胞凋亡可促进细胞增殖，保护成骨细胞。PTGS2蛋白主要参与炎症和有丝分裂的发生，同时PTGS2 与其他预测所得出的靶点都有密切联系[34]，是前列腺素生成的主要限速酶，前列腺素可以诱导M-CSF 以及RANKL 的表达，促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞功能[35]。CA2是破骨细胞骨吸收的重要标志物，其中CA2与破骨细胞泌酸功能密切相关[36]，破骨细胞分泌酸主要是通过CA2 将CO2和H2O 结合成H2CO3，再分解为H+和HCO3-，为质子泵提供H+[37]。分子对接结果也证明了鹿茸活性成分均可以与CA2 很好的结合从而起到较高抑制作用。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，依据网络药理学的分析结果，MC3T3-E1 细胞试验验证了鹿茸是很好的抗OP 天然药物，且对关键靶点具有一定调控作用。

综上所述，本研究通过网络药理学等方法探讨了鹿茸抗OP 疾病的主要成分与作用靶点，并应用分子对接和细胞试验验证了鹿茸具有很好的抗OP 活性。本研究表明鹿茸是多成分、多靶点、多通路协同作用发挥抗OP 疗效，且阐明了其生物学过程与主要通路，本课题组将进一步开展体内和体外生物学试验，为鹿茸抗OP 作用提供科学依据。此外，随着人们对传统名贵药材研发的特色保健食品需求的增多，可应用酶工程等技术进行鹿茸肽富集，为其在保健食品和医药等领域的开发应用提供新思路。