基于GEO芯片挖掘联合网络药理学及分子对接探讨当归补血汤治疗股骨头坏死分子机制

黄为，黄有荣，章晓云，韦宗波，叶来生，冯海波，李宏宇，孟林※

（1.广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西 南宁 530011；2.湖南中医药大学第二附属医院骨科，湖南 长沙 410005；3.广西骨伤医院，广西 南宁 530000）

股骨头坏死是骨科常见且难治性疾病之一，是由于股骨头血供受损，进而导致骨组织凋亡，出现股骨头塌陷，造成患者关节疼痛，功能障碍的疾病。据流行病学结果表明，目前我国约有812 万例非创伤性股骨头坏死患者，并且每年新增约10～20 万例[1,2]。如果早期没有进行有效的干预和治疗，将会进一步加重髋关节活动受限，甚至是导致残疾，严重影响患者身心健康和生活质量，给患者带来极大的痛苦[3]。目前，股骨头坏死的发病原因及机制还不是十分清楚。现代医学暂未发现有效的治疗药物，而近年来通过大量临床实践与细胞、动物实验发现，祖国医学部分中药对治疗股骨头坏死具有独特的优势[4]，其不仅可以缓解股骨头坏死的进程，还可以促进坏死的骨组织修复，逐渐被人们认可。

目前有不少学者对股骨头坏死相关中药复方进行研究，但缺乏对发病机制的阐明与系统总结。当归补血汤史载于李东垣所著《内外伤辨惑论》，由黄芪、当归两味药以5:1 组成，是益气补血的经典名方。现代药理研究表明[5,6]，其具有促进造血、调节免疫功能和保护肝脏等作用，不仅可以增强股骨头内骨组织的成骨信号和成血管信号，还可以改善骨密度，从而起到减缓股骨头坏死的作用。因此，本文通过GEO 数据挖掘、网络药理学与分子对接的技术，探讨当归补血汤活性成分、靶点与ONFH 之间的关系，以期为ONFH 的药物开发提供一定的参考和依据。

1 材料和方法

1.1 当归补血汤活性成分预测

利用TCMSP 数据平台检索并筛选出当归补血汤中当归和黄芪2 味中药的活性成分。同时以类药性（DL）≥0.18 与口服生物利用度（OB）≥30% 为筛选指标，筛选出当归补血汤中活性成分所对应的药物靶点。并把所得到的药物靶点名称借助UniProt 数据库进行基因信息匹配、数据处理转化为靶基因名称。

1.2 股骨头坏死靶点预测

通过GeneCards、PharmGkb 及OMIM 数据库，将“Osteonecrosis of the femoral head”作为关键词，进行筛选股骨头坏死相关的治疗靶点。再从GEO（Gene expression omnibus）数据库检索出与股骨头坏死相关的基因表达谱数据，并查找符合条件的基因芯片数据集；再利用GEO 数据库中的GEO2 R进行在线分析，以|logFC|≥1.5 且P ＜0.05 为差异表达基因的筛选条件，最后通过微生信在线数据库对差异基因绘制差异基因热图及火山图。

1.3 当归补血汤与股骨头坏死共有靶点基因的筛选

将当归补血汤中药物靶点基因和股骨头坏死疾病的靶点基因上传至在线微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）数据库获取共同靶点基因，同时绘制Venn图，获得当归补血汤与股骨头坏死疾病共有的靶点基因。

1.4 “当归补血汤活性成分-作用靶点”以及“当归补血汤-活性成分-股骨头坏死”网络图的构建

将当归补血汤的活性成分与作用靶点数据导入Cytoscape 软件中，进行“当归补血汤活性成分-作用靶点”网络的构建。同时使用Cytoscape 软件中的CytoNCA 插件计算出网络节点的自由度（Degree），根据Degree 的大小与相关节点数量呈正比，筛选出靶点数目较多的关键活性成分。再将当归补血汤活性成分、当归补血汤-股骨头坏死共同靶点基因、当归补血汤和股骨头坏死数据导入Cytoscape 软件中，进行“当归补血汤-活性成分-股骨头坏死”网络图的构建。

1.5 PPI网络及核心靶点蛋白互作网络的构建

将当归补血汤-股骨头坏死的共同靶点基因导入String 在线数据库进行分析，同时设置物种为“Homo Sapiens”，取最低置信度为0.4，可得到当归补血汤治疗股骨头坏死的PPI 网络图，然后使用Cytoscape 软件中插件Network Analyzer 功能进行PPI 网络分析，计算网络中每个靶点的度值（Degree），按度值的高低设置每个节点大小及颜色，取排名前10 的靶点为核心靶点，获取当归补血汤治疗股骨头坏死的核心靶点，并建立核心靶点蛋白互作网络图。

1.6 GO功能分析与KEGG富集分析

将当归补血汤-股骨头坏死的共同靶点基因数据导入DAVID 在线平台进行GO 功能富集分析以及KEGG通路富集分析，并将富集得到的数据导入Excel，再根据P ＜0.05 的结果进行筛选，当P ＜0.05 时表示富集结果显著。再将筛选后的数据传入在线微生信软件，最后绘制GO 功能分析柱状图和KEGG 富集分析气泡图。

1.7 构建“信号通路-基因”关系网络图

将步骤1.6 所得与股骨头坏死联系密切的信号通路与其对应的基因导入Cytoscape 中，分析这些信号通路及其所调控的基因，并绘制“信号通路-基因”关系网络图。

1.8 分子对接验证

将1.4 中所得的当归补血汤中的关键活性成分以及1.5中所得的核心靶点进行分子对接，首先从TCMSP在线数据库中筛选出关键活性成分的小分子配体2D结构，再利用Chem3D 软件将关键活性成分的小分子配体2D 结构转换为3D 结构；然后从PDB 数据库中获取核心蛋白基因的3D 结构，之后使用PyMOL 软件进行处理，将水分子、磷酸根及小分子配体进行去除，然后采用AutoDockTools 软件将配体与受体格式转换为pdbqt 格式，并通过Vina 软件进行分子对接。按照结合自由能（Gbind，kJ/mol）大小来评估二者的结合活性，选取结合自由能≤-5.0kJ/mol 作为筛选标准，来评价其预测的可靠性，最后使用PyMOL 进行作图。

2 结果

2.1 当归补血汤活性化合物的筛选结果

通过TCMSP 数据库共获得当归补血汤的有效成分345 个，其中黄芪87 个，当归125 个，然后将OB≥30% 和DL≥0.18 作为筛选标准对其进行筛选，共得到中药复方22 个活性化学成分，其中黄芪为20 个（其中3 个无对应靶点），当归2 个，主要活性成分的基本信息，见表1。

表1 当归补血汤中潜在活性成分的基本信息Table 1 Basic information on potential active ingredients in Danggui Buxue Decoction

2.2 股骨头坏死作用靶点筛选结果

从GEO 数据库中选择股骨头坏死相关的芯片，得到编号为：GSE123568 的芯片数据文件和GPL15207基因注释文件，本芯片总共40 个独立样本，包括股骨头坏死患者30 例和健康对照者10 例；利用GEO2 R进行在线分析，共获得49 293 个PF 差异基因，并绘制火山图，见图1。以P ＜0.05 和|logFC| ≥1.5 为筛选条件，分别选取排名前15 的上调差异基因与下调差异的基因，绘制热图（其中A 组为健康对照者，B 组为股骨头坏死患者），见图2。其中红色代表上调基因，绿色则表示下调基因，颜色程度越高，则表明这些基因可能在股骨头坏死的发病机制中发挥的作用就越大。筛选后共获得309 个DEGs，其中有253 个为上调基因，56 个为下调基因。再通过GeneCards、PharmGkb及OMIM 等数据库，将“Osteonecrosis of the femoral head”作为关键词，进行筛选股骨头坏死相关的治疗靶点，共获得股骨头坏死的相关靶点731 个。最后将GEO数据库纳入，删除重复项后共纳入902 个股骨头坏死靶点基因。

图1 GSE123568 的芯片差异基因热图Fig.1 Chip differential gene heat of GSE123568

图2 GSE123568 的芯片差异基因火山图Fig.2 Chip differential gene volcano map of GSE123568

2.3 当归补血汤-股骨头坏死共同靶点基因的预测结果

本研究通过TCMSP 数据库共获得中药复方当归补血汤活性成分靶点203 个，将2.2 所得的疾病靶点基因与药物靶点基因取交集共获得45 个共同靶点基因并绘制Venn（图3）。

图3 当归补血汤-股骨头坏死共同靶点基因韦恩图Fig.3 Danggui Buxue Decoction-Venn diagram of common target genes for femoral head necrosis

2.4 “当归补血汤活性成分-作用靶点”以及“当归补血汤-活性成分-股骨头坏死”网络图的构建

借助Cytoscape 软件（版本3.8.0）构建当归补血汤治疗股骨头坏死的“当归补血汤活性成分-作用靶点”网络，共获得15 个活性成分节点、45 个作用靶点节点和99 条边线，见图4。同时通过Cytoscape 软件构建“当归补血汤-活性成分-股骨头坏死”网络，共获得15 个活性成分节点、45 个作用靶标节点和159条边线，见图5。图4 结果表明该网络中Degree 值排名前5 位的关键活性成分分别是山柰酚、槲皮素、芒柄花素、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇和异鼠李素等，这些可能为当归补血汤治疗股骨头坏死的主要潜在作用靶点，其基本信息如表2。

图4 当归补血汤活性成分-作用靶点网络关系图Fig.4 Relationship diagram between active ingredients and action target network of Danggui Buxue Decoction

表2 当归补血汤关键活性成分的基本信息Table 2 Basic information on key compounds of Danggui Buxue Decoction

2.5 PPI网络及核心靶点蛋白互作网络的构建

利用Cytoscape 软件共挖掘出PPI 蛋白互作网络45 个靶点节点、611 条靶点蛋白间的互作关系（图6），其中Degree 值越高，图中的节点也就越大，对应椭圆形颜色就越深，代表在整个网络中的作用也就越大。结果表明，Degree 排名前10 的共包括炎性细胞因子白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、基质金属肽酶9（MMP9）、肿瘤坏死因子及炎性细胞因子白细胞介素1（IL-1）等靶点基因，见图7。这些靶点基因在整个网络中起着至关重要的作用，可能是治疗股骨头坏死的核心靶点。

图6 当归补血汤治疗股骨头坏死的蛋白互作网络图Fig.6 Protein interaction network diagram of Danggui Buxue Decoction in treating femoral head necrosis

图7 核心靶点蛋白互作网络图Fig.7 Core target protein interaction network diagram

2.6 GO 功能分析

将45 个共同靶点基因导入DAVID平台进行GO功能分析，共获得373 个条目（P ＜0.05），其中生物过程（BP）条目为294 个、细胞组分（CC）条目为26 个，分子功能（MF）条目为53 个。从生物过程的相关条目分析，主要参与转录的正调控，DNA 模板基因表达的正调控、RNA 聚合酶II 启动子转录的负调控、细胞增殖的正调控、炎症反应、凋亡过程的正调控、对药物的反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的负调控等过程；从细胞组分的相关条目分析，主要包括细胞外间隙、细胞质、细胞质核周区等区域；从分子功能的相关条目分析，主要与蛋白质结合、细胞因子活性、蛋白激酶结合等方面相关。按P 值大小排序，选取每个模块靠前10位的条目进行展示，见图8。

图8 GO 功能富集分析Fig.8 GO functional enrichment analysis

2.7 KEGG 富集分析及“信号通路-基因”关系构建

将45 个共同靶点基因导入DAVID 平台进行KEGG 富集分析，共获得信号通路101 条，然后根据P 值的大小进行排序，筛选出排名靠前的20 位条目，见图9。主要涉及PI3K-Akt、MAPK、TNF、AGERAGE、IL-17 等信号通路，将这5 条信号通路及其对应的基因数据导入Cytoscape 软件进行“信号通路-基因”关系网络的构建，见图10。结果表明，当归补血汤治疗股骨头坏死通过多靶点、多成分、多信号通路共同作用。其中TNF信号通路包含了11 个交集基因，6 个核心基因，这些基因可能从细胞增殖的正调控、炎症反应、凋亡过程的正调控、凋亡过程的负调控、细胞增殖的负调控等方面来调节股骨头坏死的发生与发展，在当归补血汤治疗股骨头坏死过程中具有重要的地位，同时将当归补血汤治疗股骨头坏死发挥重要调控作用的靶点进行红色标记展示，见图11。

图9 KEGG 信号通路气泡图Fig.9 KEGG signal pathway bubble diagram

图10 信号通路-基因关系网络图Fig.10 Signal pathway gene relationship network diagram

图11 TNF 信号通路图Fig.11 TNF signal pathway diagram

2.8 分子对接验证

将2.4 项所得的5 个关键活性成分与2.5 项所得的10 个核心靶点进行分子对接，结果显示当归补血汤关键活性成分与核心靶点蛋白的分子对接结合能均＜-5 kJ/mol，当结合能＜0 kJ/mol时表明配体与受体之间存在结合活性，当结合能＜-5.0 kJ/mol 时表明结合活性强[7]。结果表明当归补血汤中关键活性成分与核心靶点蛋白有较好的结合活性，结果见表3。选取亲和力排名前4 的槲皮素分别与细胞因子白细胞介素6（IL-6）、基质金属肽酶9（MMP9）、肿瘤坏死因子进行分子对接展示；山柰酚与肿瘤坏死因子进行分子对接展示，见图12。

图12 当归补血汤关键活性成分与核心靶点的分子对接Fig.12 Molecular docking between key active ingredients and core targets of Danggui Buxue Decoction

表3 当归补血汤的关键活性成分和核心靶点的分子对接结果Table 3 Molecular docking results of key active ingredients and core targets of Danggui Buxue Decoction 单位：kJ/mol

3 讨论

中医学将股骨头坏死归属于“骨蚀”等范畴，且在《灵枢·长刺节真邪》曾有论述：“虚邪之入身也深……内伤骨为骨蚀”，认为ONFH 主要是因为先天不足，邪气入骨，久留致病等，描述其病机多与血瘀痰阻、经络阻滞、肝肾亏虚、气血不足等密切相关[8]，并在股骨头坏死早期，患者多表现为气滞血瘀与气血两虚证候，因此采用活血祛瘀、养血益气的方法治疗股骨头坏死至关重要[9]。临床上多使用当归补血汤治疗股骨头坏死，其通过降低股骨头骨细胞凋亡，增加其骨细胞密度，抑制破骨细胞，从而起到减缓股骨头坏死发生的目的[10]，但其药理机制尚未清楚，因此文章采用GEO 数据挖掘、网络药理学和分子对接技术，从微观层面探讨该方治疗股骨头坏死的分子机制，以期为下一步研究当归补血汤治疗股骨头坏死的药理机制提供方向和参考。

本研究发现，当归补血汤发挥治疗作用的关键活性成分由槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、芒柄花素（Formononetin）和异鼠李素等组成。槲皮素、芒柄花素及山柰酚均属于黄酮类化合物，存在于诸多传统中药材中，有研究表明槲皮素、山柰酚等能够调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-k（NF-k）、Wnt/ -连环蛋白和骨形态发生蛋白-2/SMAD（BMP-2/SMAD）等信号通路来影响骨的重建[11]。槲皮素活性成分不仅可提高抗氧化活性和清除自由基，还可抑制破骨细胞生成，促进骨形成作用[12]。此外山柰酚也具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗骨质疏松以及抗过敏等功效[13]。已经有研究证明山柰酚可促进成骨细胞的分化，并能通过降解p62/SQSTM1 来抑制自噬激活的细胞凋亡，从而降低破骨细胞的分化程度[14]。而芒柄花素同为异黄酮类植物化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节免疫雌激素样及预防骨质疏松等多种功效[15]。研究表明芒柄花素能够通过抑制破骨细胞中CTSK、TRAP、MMP9、Car2 等相关功能基因的表达，从而可防治骨质破坏，最终达到减缓股骨头坏死和塌陷的作用[16]。目前尚未发现异鼠李素和7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇与股骨头坏死治疗的相关文献报道，但研究发现7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇在心血管疾病、血液系统疾病、慢性炎症性疾病和神经系统疾病方面具有潜在的价值，因此在今后的研究中值得进一步深入挖掘。

通过PPI 网络表明IL-6、VEGFA、MMP9、TNF-及IL-1B 可能是当归补血汤治疗股骨头坏死的核心靶点。白细胞介素-6（IL-6）是一种促炎细胞因子，可调节成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的活性[17]。Gao等[18]的研究发现，股骨头坏死III 期滑液促炎细胞因子IL-6和CTX-II 水平显著升高，并有肉眼可见的骨质塌陷，且在股骨头坏死II 期关节软骨中，软骨细胞周围有对称的软骨基质沉积。血管内皮生长因子-A（VEGF-A）是一种高度保守的分泌信号蛋白，具有促进软骨内骨形成、增加血管通透性、促进细胞迁移等作用[19,20]。有研究表明，VEGF能够增强血管通透性，并影响体内外破骨细胞的骨吸收，从而影响股骨头坏死的修复[21]。白细胞介素-1B（IL-1B）是炎症性关节炎发展中的关键调节因子，也是软骨降解中重要介质[22]。Yu 等[23]通过对激素性股骨头坏死患者IL-1B 基因的筛选试验中发现，IL-1B 基因影响类固醇诱导的股骨头坏死的遗传易感性。MMP-9 与MMP-13 及血管内皮生长因子是骨骼组织重塑的关键调节因子，能参与内皮细胞、破骨细胞、软骨细胞和骨祖细胞的募集和分化[24]。安非梦等[25]研究发现，MMP9 不仅在骨重塑过程中起着重要的作用，而且能促进炎症细胞的表达。因此，不管是炎症反应还是成骨与破骨细胞平衡被打破都可能进一步导致股骨头坏死的发生。

GO 功能富集分析显示，当归补血汤治疗ONFH主要涉及调控细胞增殖、凋亡及炎症反应等方面。KEGG 信号通路主要富集在PI3K-Akt、MAPK、TNF及IL-17 等信号通路，预测了当归补血汤可能通过调节炎症反应、破骨细胞增殖和细胞凋亡等方面治疗股骨头坏死。白细胞介素17（IL-17）在炎症反应和自身免疫性疾病的发展中发挥着重要作用。IL-17 家族通过发送相关信号给受体蛋白，从而激活NF-B、MAPKs等下游通路，进一步促进趋化因子和细胞因子的表达[26]。而NF-B 是一种具有多效性的转录因子，能够调控破骨细胞的生成与发展[27]。Zou 等[28]在髋关节滑液和外周血样本的实验中发现，辅助性T 细胞17（T-helper 17,Th17）被聚集到发炎的滑膜中，炎性细胞因子IL-17在股骨头坏死患者的髋关节滑膜中表达水平升高，研究表明IL-17 将有助于成为治疗股骨头坏死的新策略，进而来减少患者的炎症和疼痛。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）是脂质激酶，参与细胞增殖、黏附与运动等过程。在PI3K/Akt 信号通路中，通过磷脂酰肌苷激酶的刺激，使蛋白激酶B（Akt）与细胞膜结合，进而促进Akt 从细胞质转移到细胞核，并进一步导致各种细胞增殖、凋亡、迁移、囊泡转运以及细胞癌变的生物学效应[29]。Lu 等[30]在建立SONFH 的大鼠模型中发现，与正常大鼠相比，在SONFH 的股骨头中FOXO1 转录因子活性表达增加，且凋亡细胞数量也随之增加，继而导致骨细胞空洞、骨组织含量和股骨头完整性降低。值得注意的是，在胰岛素样生长因子-1（IGF-1）治疗后，糖皮质激素诱导的SONFH 的作用可得到缓解。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是广泛存在的高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，主要参与细胞增殖、凋亡及蛋白质生物合成等生物过程[31]。Liao等[32]通过建立兔股骨头坏死模型的研究中发现，过度表达miR-122-5p 的外泌体可通过RTK/Ras/丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，来下调SPRY2 蛋白，从而可减缓股骨头坏死的发展。肿瘤坏死因子TNF）作为重要的促炎细胞因子，被认为与巨噬细胞、破骨细胞增殖和分化有关。研究发现，在激素性股骨头坏死中，成骨细胞中TNF、核因子受体活化因子以及骨保护素的表达增加，可导致破骨细胞的分化减缓[33]。研究表明[34]，在糖皮质激素所致的骨坏死过程中，白细胞介素-4（IL-4）可以影响糖皮质激素对巨噬细胞的调控，继而降低STAT1-Caspase-3 信号通路的表达，最终减少TNF所致股骨头坏死的发生。

4 展望

通过以上分析，文章通过GEO 数据挖掘、网络药理学及分子对接对当归补血汤治疗ONFH 的机制进行了探索，发现当归补血汤治疗ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚和芒柄花素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、TNF、IL-17 等，并参与转录的正调控，DNA 模板基因表达的正调控、RNA 聚合酶II 启动子转录的负调控、细胞增殖的正调控、炎症反应、凋亡过程的正调控、对药物的反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的负调控等生物学过程，各有效成分与其作用靶点之间存在良好的结合活性与协调作用，这为当归补血汤治疗股骨头坏死的相关机制研究提供了思路和方法，也为后续新药的临床及试验研究提供了依据。同时也表明中医药治疗疾病具有多靶点、多成分、多途径的特点。另外，通过GEO 数据挖掘、网络药理学和分子对接技术虽然能够筛选出大量靶点和通路，但这些结果都有待进一步通过药理试验加以验证。