芒果MiNAC7基因的表达模式及在开花和非生物逆境胁迫应答中的功能分析

黄星 徐欢欢 黎开奖 何新华 夏黎明 陆婷婷 梁容真 罗聪

关键词：芒果；MiNAC7；生物信息学分析；表达模式；功能研究

NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）基因家族是最大的植物特有转录因子家族之一，基因成员数量庞大[1]。随着全基因组测序技术日趋完善，目前已发现绝大部分物种均存在100个以上的NAC基因数量[2]。NAC基因在影响植物生长[3]、调控植株成花[4]、果实成熟[5-6]、叶片衰老[7]和应对非生物胁迫[8-10]等生理过程中发挥了重要作用。

NAC基因家族参与多种激素调控途径和非生物胁迫应答过程。NAC基因参与调节ABA信号传导途径，如：拟南芥AtNAC016可以结合ABA依赖性胁迫信号通路中的关键转录因子脱落酸响应元件结合蛋白1基因（AREB1）的启动子，通过抑制AREB1的转录来促进对干旱胁迫的反应[11]；过表达水稻ONAC022对外源ABA的敏感性增强，与ABA有关的调控基因表达上调，即水稻ONAC022通过调节ABA信号传导途径来提高抗旱和耐盐胁迫能力[12]；陆地棉GhirNAC2直接与GhNCED3a/3c的启动子结合，通过调节GhNCED-3a/3c表达来调节ABA生物合成和气孔关闭，增强了转基因植物的抗旱性[13]。NAC基因参与调节GA信号传导途径，如甘蔗ScNAC23直接与DELLA蛋白ScGAI相互作用调节GA信号传导途径来促进甘蔗开花和叶片衰老[14]。NAC基因还参与调节生长素和细胞分裂素等途径，如水稻OsNAC2基因可以直接结合IAA和细胞分裂素（cytokinin，CK）相关基因的启动子来调节根发育过程中的细胞分裂[15]。另外，甘蔗OsNAC14可以直接与DNA修复系统中同源重组的关键成分OsRAD51A1启动子之间相互作用，招募参与DNA损伤修复和防御反应的因子来提高耐旱性[8]；梭梭HaNAC1直接与AtNAC32蛋白相互作用来增强抗旱性[16]。

芒果（MangiferaindicaL.）是重要的热带水果，适时开花有利于芒果生产[17]。前期研究中，课题组从芒果成花基因LEAFY的酵母文库筛选获得1个NAC7基因，而NAC转录因子参与了植物的逆境胁迫应答[18]。目前尚不清楚芒果MiNAC7基因是否参与了芒果的成花与逆境胁迫应答。因此，本研究对MiNAC7的生物信息学、表达模式和基因功能进行分析，明确MiNAC7基因在芒果开花和非生物胁迫中的功能。

1材料与方法

1.1材料

本研究所用芒果品种为四季蜜芒（MangiferaindicaL.cv.SiJiMi），该芒果品种生长于广西大学农学院标本园中。用于时间表达分析的样本主要为成年期的叶片，采集时间为2021年9月至2022年5月，每月1日下午5点采集1次。时间表达主要分为5个生长阶段，即营养生长期、成花诱导期、花芽分化期、花序伸长和开花期、果实发育初期。用于组织表达分析的样本主要为童期的叶、茎、芽，采集时间为2022年2月15日；成年期的叶、茎、花以及幼胚和成熟胚，采集时间为2021年11月16日。所有样品采集后立即用液氮冷冻并保存在?80℃冰箱中。本研究中使用的拟南芥为哥伦比亚型拟南芥。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析利用TBtools软件和cDNA以及DNA文件绘制MiNAC7的DNA序列结构图[19]；通过NCBI/blastp数据库对芒果MiNAC7编码的氨基酸序列进行同源查找并预测其保守结构域，利用DNAMAN软件对不同物种的NAC蛋白进行氨基酸序列比对；利用MEGA7.0软件构建NAC蛋白的系统发育树[20]；利用NewPlace数据库对MiNAC7基因前2000bp的启动子区进行分析并通过TBtools软件绘制顺式元件的分布。

1.2.2MiNAC7的表达分析芒果样品RNA采用美基公司的难提植物总RNA小提试剂盒提取，拟南芥样品RNA采用植物RNA小量提取试剂盒提取。利用M-MLV逆转录酶按照说明书将RNA逆转录为cDNA，用于后续实验。利用在线软件Primer3.0Plus设计特异引物（MiNAC7u：5?-CTGCAGACATAAACGGTGGA-3?，MiNAC7d：5?-TGGGTTGACAAGATCCAACA-3?），以芒果MiActin1为内参基因[21]（qMiACTu：5?-CCGAGACATGAAGGAGAAGC-3?，qMiACTd：5?-GTGGTCTCATGGATACCAGCA-3?）。采用TaKaRa公司的SYBRGreen和SYBRPremixExTaqII试剂，使用AppliedBiosystems7500实时定量PCR仪对MiNAC7基因的表达进行RTqPCR检测，使用2–ΔΔCT方法对荧光定量的结果进行分析[22]。

1.2.3拟南芥的转化将MiNAC7的完整cDNA序列（CDS）插入到pBI121载体中，将阳性重组质粒pBI121-MiNAC7按照说明书的方法导入农杆菌EHA105中，随后用花序侵染法对野生型拟南芥进行转化[23]。收获侵染后的种子，将其播种于含有50mg/L卡纳的1/2MS培养基中进行阳性苗筛选，利用余海霞等[24]改良的CTAB法提取阳性拟南芥的DNA，用MiNAC7的特异引物对阳性转基因拟南芥进行PCR检测与验证。对序列检测正确的阳性拟南芥进行培育繁殖，直至获得纯合株系。

1.2.4转基因拟南芥的表型分析将拟南芥置于长日照（16h光照/8h黑暗）和21℃的条件下培养，以野生型拟南芥（WT）和转空载拟南芥（pBI1121）为对照，观察转基因拟南芥的表型，统计植株第一朵花开放的时间。以T3代纯合转基因拟南芥的cDNA为模板，拟南芥基因AtACTIN2为内参基因（AtActin2u：5?-TCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3?，AtActin2d：5?-CCGTACAGATCCTTCCTGATATCC-3?），通过半定量法[25]检测芒果MiNAC7基因在转基因拟南芥中的表达水平。通过qRT-PCR法检测开花相关基因在转基因拟南芥中的表达水平（AtFTu：5?-CTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCAC-3?，AtFTd：5?-GCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGA-3?;AtAP1u：5?-CACCAAATCCAGCATCCTTAC-3?，AtAP1d：5?-GTTCGAGATCATTCCTCCTCA-3?;AtFLCu：5?-ACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGG-3?，AtFLCd：5?-CATGAGTTCGGTCTTCTTGGCTC-3?）。

1.2.5转基因拟南芥的非生物逆境胁迫处理将T4代转基因拟南芥幼苗置于长日照培养箱经过3d培养后转入逆境培养基中，竖直放置并继续培养5d后，拍照并记录野生型和转基因拟南芥的根长表型和鲜重。逆境胁迫处理所用的试剂及浓度设计如下：盐胁迫使用浓度为0、100、125mmol/L氯化钠（NaCl）；干旱胁迫使用的甘露醇（mannitol）浓度为0、300、400mmol/L；ABA浓度为0、5μmol/L，GA3浓度为0、5、10μmol/L。

1.3数据处理

本研究所有数据（如表达分析、表型分析和非生物胁迫逆境分析数据等）均使用Excel软件进行统计处理，采用IBMSPSS25.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重范围检验，利用GraphPadPrism9绘制条形图，P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2结果与分析

2.1MiNAC7生物信息学分析

MiNAC7基因DNA全长为3631bp，编码区长度为1137bp，编码379个氨基酸，等电点为4.88，蛋白质分子量为93.41kDa。MiNAC7有4个内含子，5个外显子（图1A）。利用MEGA7.0软件构建了NAC蛋白的系统进化树（图1B），芒果MiNAC7与阿月浑子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性为69.64%，且MiNAC7与PvNAC26、CcNAC29、CcNAC100、CsNAC29、LcNAC39同源性较高。故对这6个物种的NAC氨基酸序列进行比对，其保守结构域如图1C所示，6种蛋白的N端表现出高度的相似性，氨基酸序列中含有1个NAM保守结构域，是NAC基因家族的典型结构域，C端表示出明显的差异。对MiNAC7基因的起始密码子前2000bp的启动子区域进行顺式元件分析（图1D），MiNAC7基因启动子主要包含6种不同类型的顺式调控元件，即光响应元件（lightresponseelement）、ICE转录因子结合位点、MYB转录因子结合位点、赤霉素响应元件（gibberellinresponse）、茉莉酸响应元件（jasmonicacidresponseelement）以及生长素响应元件（auxinresponseelement）等。

2.2MiNAC7基因的表达模式分析

特性，采集童期和成年期的不同组织进行表达模式分析。如图2A所示，MiNAC7基因在各个组织中均表达，但表达存在差异，MiNAC7在童期组织的茎中表达最高，其次是在芽中，在叶中表达很低，在成年期的茎中表达水平较高，在花和叶中表达很低；表明MiNAC7基因在茎中优势表达。为了探究MiNAC7基因在四季蜜芒中不同生长发育时期的表达特性，利用qRT-PCR对不同时期的表达模式进行分析。如图2B所示，MiNAC7基因在不同时期的叶片中均存在不同程度的表达，其中在营养生长期的叶片中维持较高的表达水平，在成花转变期和花发育期的叶片中表达水平很低，说明MiNAC7基因与植物生长发育有关。

2.3MiNAC7转基因拟南芥对开花的影响

将构建好的载体采用花序侵染法转化野生型拟南芥植株后，筛选阳性株系并繁育至T3代纯合植株。通过半定量PCR技术检测MiNAC7在转基因拟南芥中的表达情况，结果如图3A1所示，MiNAC7在这3个转基因株系（OE-2、OE-3、OE-6）中均可以正常表达，而在野生型（WT）和转pBI121空载拟南芥中不表达。以野生型拟南芥（WT）和转空载pBI121拟南芥为对照，观察MiNAC7转基因拟南芥的开花时间。结果如图3A所示，MiNAC7转基因拟南芥显著延迟开花，开花时间比对照植株晚约4d（图3B）。转基因拟南芥开花内源基因表达水平检测显示，MiNAC7转基因拟南芥中促花基因AtFT和AtAP1的表达水平被显著下调，而抑制成花基因AtFLC的表达水平被显著上调（图3C）。

2.4MiNAC7转基因拟南芥对逆境胁迫应答的影响

为了解MiNAC7在非生物逆境胁迫中的功能，对野生型拟南芥和3个超量表达株系进行盐胁迫处理（0、100、125mmol/LNaCl）、干旱胁迫处理（0、300、400mmol/L甘露醇）和激素处理（0、5μmol/LABA，0、5、10μmol/LGA3），结果见图4。在对照组中，野生型与MiNAC7转基因拟南芥在根长和鲜重上差异不显著，实验组的野生型与MiNAC7转基因拟南芥在根长和鲜重上差异显著。盐胁迫处理使拟南芥根长生长受到抑制，但MiNAC7转基因拟南芥的根长受到的抑制显著小于野生型拟南芥。干旱胁迫抑制了拟南芥根长生长，鲜重重量降低，但MiNAC7转基因拟南芥的根长受到的抑制比野生型拟南芥轻，鲜重比野生型拟南芥重。GA3激素处理使拟南芥根长和鲜重均受到不同程度的影响，5μmol/LGA3激素处理促进了MiNAC7转基因拟南芥的根长生长，鲜重升高，但对野生型拟南芥的根长生长无显著差异；10μmol/LGA3激素处理与5μmol/LGA3激素处理相比，野生型拟南芥和MiNAC7转基因拟南芥的根长生长均被抑制。在5μmol/LABA激素处理下拟南芥表型差异明显，植株弱小，MiNAC7转基因拟南芥的根长比野生型拟南芥的短。综上所述，过表达MiNAC7基因增强了转基因拟南芥对ABA的敏感性、抗GA3以及抗旱和耐盐碱能力。

3讨论

NAC基因家族广泛存在于大量物种中，在植物激素信号传导，成花发育、果实成熟、叶片衰老等植物生长发育过程以及高盐、干旱、低温或高温等非生物胁迫中起重要作用[26]。通过酵母双杂交文库筛选，挖掘获得了1个NAC类转录因子，命名为MiNAC7，NCBI同源性比较分析显示，MiNAC7与多个被命名为不同名字的NAC基因具有同源性，其中与阿方索芒果MiNAC7的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.16%和96.04%。进化树分析显示芒果MiNAC7与阿月浑子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性为69.64%。启动子顺式元件分析表明，芒果MiNAC7基因可能受到光照、激素以及逆境胁迫的调控。

不同物种NAC家族基因表现出不同的表达模式。蜡梅CpNAC68在成熟叶和花上特异表达[27]，小麦TtNAC2A在叶和根中特异表达[28]。黄瓜NAC基因家族中有11个基因的优势表达部位是茎[29]，菊花菜NAC基因家族中有3个成员在茎的生长发育过程中起重要的调控作用[30]。在本研究中，芒果MiNAC7基因在童期组织中的表达水平相对于成年期更高，在童期茎的表达量最高，与北沙柳SpsNAC005的研究结果相似[31]。芒果时空组织分析结果显示，MiNAC7基因在营养生长期表达量较高，但在成花转变和花发育期表达水平较低，说明MiNAC7与芒果成花有关。

在植物开花时间的调控中不同的NAC基因具有不同的功能。甘蔗ScNAC23的过表达促使转基因拟南芥提前开花[14]，黄麻CcNAC1可以让植物的花期提前[32]，OsNAC7亚家族CHR00069684基因使转基因烟草提前开花[30]。本研究中，MiNAC7过表达的转基因拟南芥延迟开花，并下调开花促进基因AtFT和AtAP1的表达，上调成花抑制基因AtFLC的表达，说明MiNAC7通过调控成花相关基因的表达进而影响转基因植株成花。芒果MiNAC1基因不影响转基因拟南芥的開花时间[33]，说明不同类型的NAC基因在调控植物成花过程中的功能存在差异。

植物NAC转录因子在多种非生物胁迫应答中起重要作用，在NaCl、甘露醇或ABA胁迫条件下，刚毛柽柳ThNAC13转基因植物的根长和鲜重与野生型植物相比均显著增加[34]。在ABA胁迫条件下，南荻MlNAC10[35]、欧李ChNAC1[36]转基因植物都增加了对ABA的敏感性。在本研究中，100、125mmol/L浓度的盐胁迫处理和300、400mmol/L的干旱胁迫的转基因拟南芥根长均比野生型拟南芥根长较长，鲜重比野生型拟南芥重。5、10μmol/LGA3激素处理促进了MiNAC7转基因拟南芥的根长生长，在5μmol/LABA激素处理下转基因拟南芥根长较短，说明MiNAC7也参与了植物的逆境胁迫应答过程。这与芒果MiNAC1基因在逆境胁迫方面的研究结果相似[33]。

综上所述，芒果MiNAC7基因不仅参与调控植株开花，同时响应非生物逆境胁迫应答。