兰科蒙自兰快速繁殖和试管开花的研究

邵丽 曾歆花 黄卫昌

关键词：蒙自兰；无菌播种；快速繁殖；试管开花

蒙自兰[Mengziafoliosa（King&Pantl.）W.C.Huang，Z.J.Liu&C.Hu]，是兰科蒙自兰属多年生草本植物，主要分布于中国云南南部、泰国的山坡林下。基于前期形态学和分子系统学的分析结果，华白及[Bletillasinensis（Rolfe）Schltr.]区别于兰科龙嘴兰族的白及属和其他属植物。因此，以华白及作为模式种，建立兰科新属——蒙自兰属[1]。当前，由于生境破坏和人为干扰，蒙自兰野外居群和植株数量极少，目前已被列为国家保护的濒危植物[2]。此外，蒙自兰在引种栽培和繁育过程中也存在生长缓慢、开花少和结实困难等问题，这极不利于蒙自兰野外种群的恢复和重建。兰科植物种子数量巨大，一个果荚内含有成千上万粒种子，通过无菌播种技术能快速繁殖大量种苗；此外，通过试管开花技术能打破天气、季节和地域的限制，可提高植物开花率和结实率，从而满足植物资源保护和可持续开发利用所需的植物材料。目前，国内外对兰科植物组培快繁和试管开花的研究有较多报道，如春兰[3]、建兰[4]、寒兰[5]、铁皮石斛[6]、梳唇石斛[7]、春石斛[8]、虎舌兰[9]、报春石斛[10]和扇形文心兰[11]等。而濒危兰科植物蒙自兰由于稀缺的野外材料，其无菌播种繁殖、药效和试管开花等相关研究均处于空白状态。为加快该物种的保护和开发利用，亟需开展蒙自兰的快速繁育和试管开花研究。

本研究通过研究不同浓度6-BA、NAA、营养物质对蒙自兰生长的影响，以及6-BA、NAA、TDZ、2，4-D、PP333对试管开花的影响，筛选出最佳培养基配方，建立一套高效的快繁技术体系。不但可以为该物种的种群回归和恢复等保育生物学研究提供帮助，还能为其开花调控机理研究和缩短育种周期提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试材料取自云南人工授粉的蒙自兰未开裂果荚。

1.2方法

1.2.1种子消毒灭菌将蒙自兰蒴果在流水下冲洗0.5h，然后用吸水纸将种荚表面水分吸干后转入无菌操作台。参照王丽等[12]的方法，用75%酒精浸泡30s，然后用含少许吐温20的0.1%升汞溶液震荡消毒10～15min，无菌水冲洗5遍，滤纸吸干表面水分后待用。

1.2.2种子萌发（1）不同成熟度种子的萌发。播种不同成熟程度的蒴果，成熟度为从自交到播种的天数分别为85、95、105、115d。剖开消毒过的蒴果，将种子均匀接种于含0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、0.2g/L活性炭，pH为5.8的1/2MS培养基上。共4组处理A1～A4，每个处理接种10瓶，每瓶约100粒种子，分别记录萌发时间和统计种子萌发数，并计算萌发率。萌发率=萌发种子数量/接入种子总数×100%。

（2）不同培养基对种子萌发的影响。基本培养基以MS和1/2MS为对照，添加不同浓度的NAA和6-BA，采用L16（43）正交表设计（表1）。设置16组样本B1～B16，每组接种5瓶，每瓶100粒种子，待种子萌发后统计萌发种子数，计算萌发率。

1.2.3丛芽增殖将萌发后长小叶的蒙自兰小苗接种至不同培养基，基础培养基为1/2MS，添加不同浓度NAA和6-BA，NAA的浓度梯度设置为0、0.2、0.5mg/L，6-BA的浓度梯度设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，不添加任何激素的作为对照组（CK）。15个处理C1～C15，每組处理10个重复150芽，60d后统计增殖率。

1.2.4生根壮苗将增殖后约同等大小的蒙自兰小苗接种至不同的生根壮苗培养基。基础培养基是1/2MS，添加不同浓度生长素和营养物匀浆，设置L16（43）正交试验表（表2）。不添加任何生长调节剂和营养物的培养基作为对照组（CK），16个处理D1～D16，每组10个重复共100苗，60d后测量生根数量、根长和苗高[13]。

1.2.5试管开花将丛芽增殖后约同等大小的蒙自兰幼苗接种至不同的催花培养基。以1/2MS为基础培养基，添加不同浓度的细胞分裂素6-BA（1.0、2.0mg/L）、TDZ（0.1、0.5mg/L）和生长素NAA（0.2、0.5mg/L）、2，4-D（0.2、0.5mg/L），两两配比，另添加多效唑PP3331.0mg/L，以不添加PP333的处理作为对照组（CK），16个处理E1～E16，每组5个重复共25苗，90d后统计开放花朵数，计算开花率和正常花率。开花率=开放花朵数/接种外植体数×100%；正常花率=正常花朵数/开放花朵数×100%。

1.2.6培养条件通过预试验发现蒙自兰从萌发到幼苗生长各阶段在1/2MS培养基上均生长良好，因此设置丛芽增殖、生根壮苗、试管开花试验的基本培养基均为1/2MS。各培养基中均加入0.2g/L活性炭、6.5g/L琼脂、30g/L蔗糖，催花培养基中另外添加30g/L香蕉匀浆，pH均调为5.8。培养室温度控制在（25±1）℃，光照时长为12h/d，光照强度为2000lx。

1.3数据处理

使用正交设计助手Ⅱv3.1软件设置正交试验表，运用SPSS16.0软件进行数据处理。采用单因素方差分析比较不同种子成熟度对种子萌发率的影响；采用多因素方差分析比较不同培养基对种子萌发率，以及不同激素浓度配比对丛芽增殖率、根长、苗高、根数量、花芽分化率和正常开花率的影响。采用TukeyHSD方法比较不同实验组的显著性差异（P<0.05）。

2结果与分析

2.1不同成熟度对蒙自兰种子萌发的影响

蒙自兰种子的成熟度对其萌发率有显著影响（表3）。授粉后85～105d的种子呈白色，萌发所需时间均在30d左右，随着种子成熟时间的延长其萌发率递增，A3与A1、A2间呈显著差异。105d的种子萌发率最高为87.00%，显著高于115d的种子萌发率，且萌发出原球茎后叶片分化快。授粉115d的种子颜色略深，萌发时间最短，但萌发率明显降低，且萌发后的原球茎叶分化率低。

2.2不同培养基对蒙自兰种子萌发的影响

成熟度为105d的蒙自兰种子播种于不同培养基上，供试的16组培养基均能萌发，但各组萌发率有显著差异（表4）。B15处理的培养基（1/2MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）的萌发率最高，为97.00%。在16组处理中，当NAA浓度相同时，萌发率随6-BA浓度的升高而增加；而当6-BA浓度相同时，较低NAA浓度的萌发率较高，其中B9和B15的萌发率接近，且B9的萌发率仅次于B15；当NAA浓度为1.0mg/L时，MS培养基的萌发率较低，B4和B8的萌发率分别为5.00%和9.40%；当6-BA浓度为1.5mg/L时，1/2MS培养基的萌发率有所降低。从表5中可知，基础培养基、NAA、6-BA对蒙自兰种子萌发的影响均存在显著性差异（P<0.05），对比三因素的F值发现，影响种子萌发率的大小顺序为基础培养基＞NAA＞6-BA。

2.3不同激素浓度对蒙自兰丛芽增殖的影响

蒙自兰种子播种后约30d萌发形成原球茎。将其转接至增殖分化培养基中发现原球茎会分化成苗，但增殖形成的愈伤组织并未分化且逐渐发黄死亡。因此在原球茎分化出叶片后再进行丛芽增殖处理。将1/2MS作为基本培养基，观察NAA和6-BA对丛芽增殖的影响（表6）。结果显示，各处理的蒙自兰丛芽均具有不同程度的增殖，未添加NAA和6-BA的CK组的增殖率显著低于添加激素处理组；C2和C4显著高于其他处理，2组处理均未添加NAA；C4处理的增殖率最大，为47.33%，其6-BA添加浓度为2.0mg/L；添加激素处理组中，C5的增殖率最低为18.01%，其6-BA添加浓度为2.5mg/L，C4和C5处理均未添加NAA。主体效应分析显示（表7），不同浓度的NAA对丛芽增殖的影响差异不显著（P>0.05），而不同浓度的6-BA对丛芽增殖的影响差异显著（P<0.05）。

2.4不同浓度NAA及营养物对蒙自兰生根壮苗的影响

将蒙自兰丛芽接种到不同培养基上，观察NAA和不同营养物质对蒙自兰生根壮苗的影响。结果表明，D15培养基1/2MS+1.0mg/LNAA+30g/L土豆匀浆处理的蒙自兰生长状况最佳，苗高、根长和根的数量均显著高于其他处理（表8）。由表9可知，各因素间呈显著性差异（P<0.05）。营养物对蒙自兰根长和根数量的影响大于NAA，30g/L土豆匀浆处理的生根效果最佳，其次是浓度10g/L，土豆匀浆超过30g/L反而抑制生根；30、50ml/L椰子水和100g/L香蕉匀浆也有利于生根，但效果比土豆匀浆差。NAA对苗高的影响大于营养物，1.0mg/L的NAA有利于幼苗茎叶生长，D14、D15处理组的苗高显著高于其他处理。

2.5不同激素浓度对蒙自兰试管开花的影响

在蒙自兰生根壮苗试验中发现，添加30g/L香蕉匀浆的培养基上幼苗有部分开花现象，故在试管开花试验培养基中以添加30g/L香蕉匀浆来促进其开花，CK组不添加。将生长健壮、苗高基本一致的蒙自兰幼苗接种到不同培养基上，观察不同激素对幼苗花芽分化和开花的影响。从表10可知，在添加PP333的条件下，E2处理的花芽分化率和正常开花率均显著高于其他处理，是最优催花培养基。观察花芽分化情况发现（图1），E1、E2、E3培养基的花梗均较长且大多植株开2～4朵花（图1A），而其他培养基处理的开花株均为1梗1朵（图1B）；与E1对比发现，未添加PP333的CK培养基幼苗无花芽分化；当添加相同浓度的6-BA时，除E6未开花，NAA与6-BA组合处理的花芽分化率显著优于2，4-D与6-BA组合处理，且花朵畸形率也较低；含2，4-D的培养基处理中，除E16外，花芽分化率均显著低于其他处理，且花朵畸形率较高；TDZ对蒙自兰花芽分化也有促进作用，0.5mg/LTDZ处理的作用效果明显高于0.1mg/LTDZ，但其花朵畸形率高于含6-BA的培养基处理，可见添加TDZ会增加蒙自兰花朵畸形率，而2，4-D对蒙自兰花芽分化有一定的抑制作用。添加0.5mg/LTDZ和0.5mg/LNAA的E12处理培养基上幼苗的开花状态为花梗短且花瓣卷曲（图1C）；添加0.1mg/LTDZ和0.5mg/L2，4-D的E14处理培养基上幼苗的开花状态为花梗短且花朵呈闭合状态直至凋谢（图1D）。

3讨论

蒙自兰在野生状态和人工栽培条件下生长缓慢，利用无菌种子培养可有效解决分株繁殖系数低、繁殖周期长的问题。本研究表明，在1/2MS培养基上，蒙自兰从种子萌发到壮苗的各阶段均能较好生长，生长调节剂对生长各阶段起到的促进或抑制作用各有差异。

种子成熟度对种子萌发有着重要影响[14]。通过解剖镜观察种子发现，蒙自兰105d的种子胚圆润饱满（图1E），而115d的种子胚缩小、种皮变厚（图1F）。用TTC溶液对种子进行染色发现，85、95、105d的种子很快被染色，而115d的种子只有少数种子被染色，且染色所需时间较长。因此，115d的种子萌发率低可能与种子活性低、胚龄长或种皮变厚有关。蒋雅婷等[15]研究发现，无距虾脊兰种子胚龄为120d时萌发率最高，随后逐渐降低，到210d时，萌发率降为0。蒙自兰野外植株数量少，组培苗养护难度高且开花难，目前能得到的果荚数量有限，因此尚未观察到其果荚自然开裂的时间和状态。种子在115d以后的萌发率是否会降到0以及果荚自然开裂的时间后续还需进一步试验加以验证。1/2MS培养基的种子萌发率均较高，说明低盐分培养基有利于蒙自兰种子萌发，这与漆子钰[3]对春兰种子的萌发研究结果一致。NAA和6-BA的不同浓度组合也影响种子萌发，1/2MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA的培养基萌发率最高为97.00%，而105d的种子在1/2MS+0.5mg/lNAA培養基中的萌发率为87.00%，在NAA浓度接近的情况下，其萌发率相对较低的原因可能是未添加6-BA。可见，培养基配方对蒙自兰种子萌发起着关键作用。

蒙自兰种子萌发后原球茎会快速进入叶分化阶段，在分化之前可以通过添加生长调节剂对原球茎进行增殖处理，但增殖出的愈伤组织未能分化成苗，可能增殖出的愈伤为非胚性愈伤组织。而对已分化出叶片的幼苗进行丛芽增殖发现均为有效增殖，且丛芽健壮，未发现徒长、弱化或玻璃化现象。在植物组织培养中，细胞分裂素可刺激细胞分裂，促进芽分化和生长[3]。不同品种兰科植物所需的生长调节剂种类、组合和浓度也不同。蒙自兰丛芽增殖试验结果表明，2.0mg/L6-BA对丛芽增殖效果最佳，这与滇金石斛[13]、血叶兰[16]丛芽增殖所需的分裂素一致，但浓度不同，且滇金石斛还需添加NAA，血叶兰还需添加NAA和TDZ。而杜鹃兰丛生芽增殖需要2.0mg/LTDZ和0.2mg/LIAA[17]，与蒙自兰不同。生长素NAA能促进试管苗生长、生根和壮苗。除生长调节剂外，一些天然营养物质，如椰青、香蕉、土豆、苹果、酵母浸出物等，对某些植物器官组织有一定的促进生长作用。椰青、香蕉和土豆被广泛应用于兰科植物的组织培养。1.0mg/LNAA和30g/L土豆为蒙自兰幼苗生根壮苗的最优组合，这与三褶虾脊兰[18]幼苗生长所需的添加物和生长调节剂种类一致，三褶虾脊兰需要100g/L土豆泥和0.1mg/LNAA。

蒙自兰试管开花试验发现，生长调节剂和营养物质对幼苗开花均有一定促进作用。部分开花株植株矮小，且球茎大、叶片宽，可能是PP333抑制植株茎的生长，刺激其提前开花的原因。这与李杰等[19]在霍山石斛花芽诱导试验中TDZ与PP333组合处理的畸形花比率高的结果一致。蒙自兰幼苗在90d内陆续开花，这与梳唇石斛[7]试管开花状态一致，但梳唇石斛开花可持续半年以上。蒙自兰单朵花期在7～10d左右，90d后花芽分化结束，这可能与培养基中营养成分的消耗有关。本研究结果显示，蒙自兰试管开花的最佳培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.0mg/LPP333+30g/L香蕉。6-BA与NAA组合处理的诱导效果最佳，这与梳唇石斛[7]的开花诱导结果一致。霍山石斛[19]在花芽诱导培养基中也添加了香蕉匀浆物。但蒙自兰开花时间不统一，個别植株从播种到开花仅需145d。兰科植物开花受多种因素的影响，除培养基成分外，还受环境因子的调控，如温度、光照强度、光照时长等[20]。本研究取得蒙自兰试管开花的初步结果，但如何提高试管开花率和花朵品质，以及诱导开花的机理仍有待进一步探索。