兰花诱变育种研究进展

罗维宇 宿庆连 曾瑞珍 袁赟 魏倩 张志胜

关键词：兰花；诱变育种；突变体；品种；研究进展

兰花是兰科（Orchidaceae）的总称，具有很高的观赏价值、药用价值、食用价值和或文化价值，深受世界各国人们的喜爱。迄今，已鉴定出兰科植物27801种，899属[1]，在英国皇家学会登录的集体杂种超过15万个。在我国，传统意义上的兰花是指兰科兰属（Cymbidium）植物，特别是其中的地生种类，也就是今天的国兰。兰花是中国传统十大名花之一，是世界著名的观赏植物，也是当今生物学领域研究生命和进化的理想模式植物。

新品种选育是兰花产业高质量发展的基础。兰花新品种选育的主要方法有引种驯化、选择育种、杂交育种、诱变育种和倍性育种等。诱变育种是指通过人为控制化学、物理因素诱导植物，使其发生遗传变异，从可遗传变异性状中挑选出有利目标性状，最终培育出新品种或种质资源的方法[2]，具有育种年限短、突变方向不确定、突变范围广、可以产生特殊变异等特点。自1979年KOZLOWSKA-KALISZ[3]使用γ射线辐照兰花以来，兰花诱变育种取得了巨大进步，获得了一批叶色叶型、花色花型改变以及抗性提升等特性的突变体。本文对兰花诱变育种研究进行综述，旨在明确兰花诱变育种现状和影响兰花诱变育种效果的因素，总结兰花诱变机理，找出进一步提高兰花诱变育种效率和效果的方法，为更好地利用诱变育种技术培育兰花新品种，深入阐明兰花诱变和进化机理提供参考。

1兰花诱变方法

兰花诱变方法主要包括物理诱变、化学诱变、空间诱变，这3类诱变方法在兰花育种中均有研究报道，其中物理诱变的研究报道最多，成效最大。

1.1物理诱变

物理诱变育种是指利用物理因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株或个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法[4]。迄今，至少已在兰属、蝴蝶兰属、石斛兰属等13个属44种兰花中开展了物理诱变育种研究，获得突变体716个，培育出小兰屿蝴蝶兰飞兰等兰花新品种12个（表1），其中5个来自突变体库（TheMutantVarietiesDatabaseoftheInternationalAtomicEnergyAgency，IAEA）。

用于兰花辐照的辐照源有γ射线[3，5-66]、重离子束[55，67-74]、快中子[75-76]和紫外线[77]等。60Co-γ射线是最常用的辐照源，近年来，采用重离子束辐照逐渐增多，与γ射线辐射相比，碳重离子辐照的植株突变频率更高，突变谱更宽[78]。LUAN等[55]分别使用60Co-γ射線和12C6+重离子辐照2种蝴蝶兰，在60Co-γ射线辐照的2种蝴蝶兰中均未发现变异系，而在12C6+重离子（3Gy）辐照的2种样本中筛选出24个变异系。

除了辐照源外，辐照材料、剂量和剂量率也是影响兰花辐照效果的重要因素。在兰花诱变育种中，多数研究人员将半致死剂量（LD50）作为最佳诱变剂量，采用的诱变材料多为原球茎、类原球茎和根状茎。不同种、品种、辐照材料的LD50不同，因此在兰花诱变育种中，确定辐照材料的LD50值十分重要。兰花根状茎辐照后，有时不同剂量处理后的材料均能存活，但生长停滞。因此，当无法用半致死量对辐射诱变效果进行评估时，有使用半减少剂量（the50%reductiondose，RD50）作为最佳诱变剂量的报道[21，23]。

物理诱变引起兰花株型、株高、分蘖性，叶数、叶形、叶色、花序、花数、花型、花色、花期，抗病性、抗虫性、组培快繁特性等性状的变化（表1）。其中叶色突变出现的频率最高，表明通过物理诱变选育兰花叶色变异新品种的成功率高。

一般认为诱变育种对改变植物个别性状是有效的，但越来越多的研究结果表明，辐照能改变兰花的多个性状。主要原因是辐照能够引起染色体数目和结构变异，导致多个基因的改变，此外一因多效等也会导致多个性状发生改变。耿庆芝[69]采用重离子辐照君豪兰根状茎，获得了株型、叶数、叶色变异等多个突变体，其中叶艺突变体植株生长缓慢、植株矮小、适应性差（图1）。

1.2化学诱变

化学诱变是指利用化学药剂与遗传物质发生生物化学反应，引起基因发生点突变[2]，具有容易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点[79]。迄今，至少已在兰属、石斛兰属、蝴蝶兰属等6个属13个兰花种中开展了化学诱变育种研究。已有结果表明，化学诱变可导致兰花株高、叶数、叶色、叶宽、抗病性、抗逆性等性状的改变，至少已获得叶色改变、矮化、抗病、抗寒等突变体206个，其中叶色改变和矮化突变体是常见的变异类型（表2）。

在兰花上使用的化学诱变剂有烷化剂[甲基磺酸乙酯（EMS），硫酸二乙脂（DES）]、呼吸抑制剂[叠氮化钠（NaN3）]、碱基类似物[5-溴尿嘧啶（5-BU），马来酰肼（MH）]以及其他诱变剂如亚硫酸钠（Na2SO3）和咖啡碱等。其中烷化剂是最常用的化学诱变剂，占65.4%；其次是叠氮化钠，占19.2%（表2）。不同诱变剂对兰花的诱变效率不同。李夏[80]使用多种化学诱变剂对寒兰原球茎进行诱变处理，结果表明，诱变效率从高到低的排序为EMS>DES>MH>Na2SO3>咖啡碱>5-BU。陈超等[81]用EMS和NaN3对蝴蝶兰类原球茎（PLB）进行处理，结果发现EMS的诱变效果比NaN3好。

诱变剂浓度、诱变方法和材料选择是影响兰花化学诱变效率的主要因素。根状茎、原球茎和类原球茎等中间繁殖体是常用的诱变材料，浸泡法是最常用的处理方法。不同材料和不同诱变剂，其诱变剂量和处理时间不同，诱变效率也不同。对兰花中间繁殖体，EMS的常用浓度为0.05%～1.00%，NaN3浓度为2.0～8.0mmol/L。EMS能在溶液中和细胞内部水解产生强酸，不仅使溶液中的EMS浓度降低，而且酸性水解产物对细胞有毒害作用，对处理材料造成生理损伤，降低存活率，从而降低了诱变效率[98]，因此EMS溶液一般用浓度不超过0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）配制，但也有将EMS直接加入液体培养基进行诱变处理，并得到较多突变体的报道[82-83]。

1.3空间诱变

空间诱变育种是指利用返回式卫星、宇宙飞船或高空气球将农作物种子带到太空，利用太空特殊的环境（空间宇宙射线、微重力、高真空、弱磁场等因素）诱发植物产生变异，再返回地面选育新品种的技术[99]，该技术具有突变谱广、诱变频率高和对植株损伤小等特点[100]。空间诱变至少已应用于石斛兰属和蝴蝶兰属2个属4个种中，已获得8个突变体、选育出4个新品种。空间诱变导致金钗石斛矮化、茎变粗、分蘖多；能促进铁皮石斛生长、提高产量；使蝴蝶兰花变大、花朵数变多、观赏期延长、抗病性抗逆性增强（表3）。石斛种子经过空间诱变选出了矮化新品种Uju[51]。陈肖英等[101]利用空间诱变技术，培育出花大色艳、抗性强和适应性好的优良蝴蝶兰新品种航蝴1号。

2兰花突变体的筛选鉴定

表型鉴定是兰科植株突变体鉴定中简单、经济、实用的方法。在组培过程中或田间观察到有植株与对照植株在株型、叶色、叶型、花色、花形、花期、抗性等方面存在明显差异时，该植株会被单独选出，通过分株繁殖、扦插繁殖或组培快繁生产株系，如果变异性状在株系内一致且稳定，一般就认为该变异植株是突变体。采用分子标记对变异植株和对照植株进行分析，如果变异植株和对照植株在DNA水平上存在差异，则进一步证明变异植株是突变体[105]，但是分子鉴定结果与植株表型性状的变化之间可能并不存在一一对应关系[6]。

兰花的营养生长期一般为3～5a。为了提早进行突变体筛选和鉴定，对于肉眼不可见、不稳定或不容易鉴定的性状，开发出新的育种目标性状突变体筛选和鉴定技术是十分重要的。在一些兰花上已建立分子标记辅助选择技术[106]、试管花诱导技术体系[107]、茎腐病抗性品种筛选和鉴定技术[70]等，有的已应用于突变体筛选。

3兰花诱变机理

诱变可以引起兰花染色体数目和结构、基因结构和表达的变异，从而导致性状改变。γ射线辐照能引起染色体数目改变，形成非整倍体[54]，也能引起核型改变[19]。对叶艺隆昌素叶艺形成的分子机理研究结果表明，编码尿卟啉原脱羧酶基因HEME在叶艺隆昌素中表达下调，而叶绿素生物合成中编码镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶基因CHLM、谷氨酸-tRNA还原酶基因HEMA和叶绿素降解相关基因表达上调，说明色素合成、叶绿体发育相关基因的差异表达可能是导致隆昌素叶艺形成的原因[5，108-109]。KIM等[24]对兰花黄叶突变体进行RNA测序分析，发现叶绿素代谢或离子运输的改变有可能导致兰花叶色变黄。LIM等[50]对石斛紫叶突变体进行转录组分析，发现突变体叶片变紫色与花青素生物合成途径中生物合成酶基因和MYB2等几个转录因子表达增加有关。卓志勇[110]用IlluminaHiseqX技术对君豪兰和重离子辐照诱变形成的线艺君豪兰叶片、根和茎混样进行转录组测序和基因表达分析，筛选出2個与兰花线艺性状突变有关的候选基因，分别为CYP76B10和PSBO。

4展望

兰花是中国的传统十大名花之一，中国人赏兰不仅赏花，而且赏叶。诱变处理可以诱导兰花产生丰富的遗传变异，特别是诱导兰花产生丰富的株型和叶部性状变异，因此诱变育种非常适合我国兰花育种工作。随着我国经济发展和科技进步，可以进一步提高诱变当代突变效率和突变谱的诱变新技术（重离子辐照、空间诱变等）的不断出现，兰花诱变育种技术有望成为进一步加快我国兰花育种进程，尽快缩小与国外在兰花育种上差距的关键技术之一。

进一步提高诱变育种效率和效果是今后兰花诱变育种研究的主要任务，可以主要从以下几个方面深入系统地开展研究工作。首先是进一步提高诱变效率。筛选高效诱变剂、适宜的诱变材料和方法依然是建立高效诱变育种技术体系的基础性工作，在此基础上，可通过多种诱变技术的结合进一步提高诱变效率[64]。其次是建立高效突变体筛选和鉴定技术体系。随着基因组测序和功能基因组学研究的不断深入，兰花高密度分子遗传图谱的建立和主要育种目标性状关键基因的挖掘不断取得新进展[111]，在此基础上，建立高效分子标记辅助选择体系和定向诱导基因组局部突变（TargetingInducedLocalLesionsINGenomes，TILLING）等技术成为可能，这些技术在兰花诱变育种上的应用将进一步提高突变体筛选和鉴定效率。再次是建立兰花快速高效育种技术。将杂交、诱变和细胞工程技术相结合，建立多种育种技术相融合的兰花快速高效育种技术不仅可以提高兰花育种效率，而且可以缩短兰花育种周期，快速培育优良兰花新品种。最后是进一步明确兰花诱变育种的倍性效应。多数兰花商业化品种是多倍体[112-113]，不同倍性兰花品种诱变效果可能有差异，因此系统开展倍性对兰花诱变育种效果的影响是非常有必要的。

诱变机理研究对进一步提高兰花诱变育种效率具有重要的促进作用。大量研究表明，诱变通过引起染色体数目改变[54]、染色体结构变异[19]、基因结构变异和表达水平变化[108-109]等改变植物性状。不同诱变剂诱导遗传物质改变的类型、频率和诱发植物变异的性状不完全相同，不同类型遗传物质的改变导致兰花性状改变的机理也不同。诱变剂是如何引起遗传物质发生改变，从而进一步导致性状改变的，目前这些机理尚不十分清楚，今后应进一步加强这方面的研究。