雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响△

2024-01-08庞彬彬夏沁韵邢怡桥

眼科新进展 2024年1期

庞彬彬夏沁韵陈震邢怡桥

自身免疫性葡萄膜炎是累及葡萄膜、视网膜等多个部位的眼内非感染性炎症,病因复杂,常可导致严重的视功能损害[1]。目前,皮质类固醇和免疫抑制剂是治疗葡萄膜炎的主要药物,但长期使用可引起局部或全身毒副作用[2]。因此,寻找安全有效的治疗药物是葡萄膜炎研究的重要课题。小胶质细胞是常驻于视网膜和中枢神经系统中的免疫细胞,参与多种神经退行性疾病和眼部疾病的发生、发展和预后[3]。研究表明,抑制M1型小胶质细胞活化或调节M1/M2型小胶质细胞极化平衡可以缓解自身免疫性葡萄膜炎的发展[4-5]。雷公藤红素是来源于中草药雷公藤的主要活性天然产物之一,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖等多种生物学功能[6-9]。研究发现,雷公藤红素可抑制阿尔茨海默病患者小胶质细胞活化,减少炎症因子产生和神经元死亡,延缓患者认知衰退;人们推测雷公藤红素能通过调节小胶质细胞极化,进而减轻葡萄膜炎的进一步发展[10-11]。本研究利用小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型,探讨雷公藤红素在EAU小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响,为葡萄膜炎的治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

取健康6～8周龄B10.RIII小鼠36只,购自Jackson实验室,饲养于武汉大学人民医院动物实验中心SPF环境中,明暗循环 12 h/12 h。动物饲养及实验操作严格遵守《湖北省实验动物管理条例》,并获得武汉大学人民医院动物伦理委员会许可[批准号：WDRM动(福)第20211206号]。

1.1.2 主要试剂及仪器

光感受器间维生素A类结合蛋白161-180 (上海生工生物工程股份有限公司),完全弗氏佐剂(美国Sigma公司),雷公藤红素(上海皓元生物医药科技有限公司),抗 GAPDH抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司),抗诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg1)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),抗离子钙结合适配器分子-1(Iba1)抗体(美国Abcam公司),AlexaFluor 488 IgG(美国Jackson公司),RNA提取及逆转录试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);CFX荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司),酶标仪(美国Perkin Elmer公司),正置荧光显微镜 BX51(日本Olympus株式会社)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理

采用随机数字表法将36只小鼠分为正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组,每组12只。参照文献[12],将光感受器间维生素A类结合蛋白161-180和完全弗氏佐剂充分乳化混合后,注射于EAU溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下,总体积200 μL,每只小鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白161-180的量为50 μg。免疫后第7天,在裂隙灯下观察小鼠眼前节反应,确保造模成功。第7-14天,雷公藤红素干预组小鼠每天接受0.5 mg·kg-1雷公藤红素腹腔注射治疗,EAU溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌PBS缓冲溶液。

1.2.2 小鼠临床评分及组织病理学评分

免疫后第14天,每组各取6只小鼠,通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现,并参照Caspi分级标准进行EAU临床评分[13]。处死小鼠,取双侧眼球,用眼球固定液固定24 h,石蜡包埋,沿瞳孔-视神经轴收集连续的4～6 μm切片,并用HE染色,在显微镜下根据Caspi分级标准进行组织病理学评分。

1.2.3 免疫荧光染色检测小胶质细胞活化情况

将各组小鼠石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后,用体积分数3%BSA-PBS封闭30 min;加抗 Iba1 抗体(12 000)4 ℃孵育过夜,PBS 洗涤;二抗 AlexaFluor 488 IgG(1500)室温孵育2 h,PBS 洗涤;最后,用DAPI 室温孵育10 min。予以抗荧光淬灭剂封片后在荧光显微镜下观察、记录各组小鼠小胶质细胞活化情况。

1.2.4 Western blot检测iNOS、Arg1蛋白表达

免疫后第14天,每组各取3只小鼠处死,摘除双侧眼球。分离小鼠视网膜组织,加入RIPA组织细胞裂解液,使用超声粉碎仪冰上粉碎裂解视网膜,离心并收集上清,BCA法检测并计算各组样品的蛋白浓度。采用100 g·L-1SDS-PAGE进行电泳,转膜、封闭处理后,加抗iNOS抗体(11 000)、抗Arg1抗体(11 000)、抗GAPDH抗体(15 000),4 ℃孵育过夜。第2天,PBST洗涤,HRP二抗室温敷育1 h,经PBST洗涤后,予以ECL显色成像。应用ImageJ软件分析条带灰度值,目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.5 qRT-PCR检测炎症因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6 mRNA表达

免疫后第14天,每组各取处死3只小鼠,摘除双侧眼球。在无酶条件下分离小鼠视网膜组织,采用Trizol提取视网膜总 RNA,将1 μg RNA逆转录成 cDNA ,随后以cDNA为模板按照如下体系进行 qRT-PCR 检测。引物序列如下：β-actin上游引物为5’-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3’,下游引物为5’-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3’;肿瘤坏死因子(TNF)-α上游引物为5’-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’,下游引物为5’-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3’;白细胞介素(IL)-1β上游引物为5’-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3’,下游引物为5’-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’;IL-6上游引物为5’-TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3’,下游引物为5’-CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3’。反应体系为每孔20 μL,反应条件为：95 ℃、30 s,循环1次;95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,循环40次;95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃、15 s,循环1次。qRT-PCR完成后,按 2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。

1.3 统计学分析

采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用q检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠眼前节表现及临床评分

免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察发现,EAU溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出;而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻,可见虹膜血管轻度充血(图1)。各组小鼠临床评分,总体差异有统计学意义(F=55.50,P<0.05);与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠临床评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 免疫后第14天各组小鼠临床评分及组织病理学评分

2.2 各组小鼠HE染色结果及组织病理学评分

HE染色结果显示,免疫后第14天,EAU溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离,炎症细胞弥漫浸润;而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微,可见少量炎症细胞浸润(图2)。各组小鼠组织病理学评分总体差异有统计学意义(F=75.76,P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

A：正常对照组;B：EAU溶剂对照组;C：雷公藤红素干预组。图2 各组小鼠视网膜组织HE染色结果(×200)

2.3 各组小鼠眼内小胶质细胞活化情况

利用 Iba1进行免疫荧光染色结果发现,免疫后第14天,EAU溶剂对照组小鼠小胶质细胞活化增多,细胞增大变形,散在分布;而雷公藤红素干预组小鼠小胶质细胞活化明显减少,主要分布于神经节细胞层、内丛状层和外丛状层。正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞密度分别为(1.00±0.12)%、(36.07±4.57)%、(1.83±0.36)%,各组Iba1+细胞数总体比较差异有统计学意义(F=57.16,P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

DAPI免疫反应细胞核阳性染色为蓝色, Iba1免疫反应小胶质细胞阳性染色为绿色。GCL：神经节细胞层;IPL：内丛状层;INL：内核层;OPL：外丛状层;ONL：外核层。图3 各组小鼠眼内小胶质细胞活化情况

2.4 各组小鼠视网膜iNOS、Arg1蛋白表达水平

Western blot 检测结果显示,免疫后第14天,各组小鼠视网膜 iNOS、Arg1蛋白表达水平总体比较差异均有统计学意义(F=19.54、10.88,均为P<0.05);与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中iNOS、Arg1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中iNOS蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),而Arg1表达水平差异无统计学意义 (P>0.05)(图4)。

**P<0.01,ns示差异无统计学意义。图4 各组小鼠视网膜iNOS、Arg1蛋白表达水平

2.5 各组小鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平

qRT-PCR检测结果显示,免疫后第14天,各组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=8.45、9.97、53.44,均为P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。

表2 各组小鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平

3 讨论

雷公藤红素于1936年被发现,它是最有可能开发成现代药物的分子之一[14]。其在多种自身免疫性疾病中发挥保护作用。本研究中,我们每天给予EAU小鼠腹腔注射0.5 mg·kg-1雷公藤红素进行治疗。结果显示,EAU溶剂对照组小鼠出现虹膜血管扩张充血、角膜水肿、前房渗出等明显炎症反应;HE染色显示EAU溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离,炎症细胞弥漫浸润。而雷公藤红素干预组小鼠炎症反应及视网膜结构破坏均明显减轻。这表明雷公藤红素可减轻EAU小鼠视网膜的炎症反应,具有很好的抗炎作用。

在生理条件下,小胶质细胞呈高度分支状,主要局限于视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层;当暴露于病理性刺激环境时,小胶质细胞迅速增大变形为阿米巴状,迁移到损伤部位,并引起许多免疫反应[15]。Iba1是检测小胶质细胞活化的经典标志物[16]。我们利用Iba1标记小胶质细胞,结果显示,正常小鼠中,小胶质细胞活化几乎不可见,而EAU免疫后小鼠眼内小胶质细胞活化明显增加,细胞增大变形,并迁移到视网膜各层及玻璃体内;而雷公藤红素干预后小胶质细胞活化数量显著减少且分布主要局限于视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层。这表明雷公藤红素可抑制EAU小鼠中小胶质细胞活化。小胶质细胞极化分为“经典激活”的M1型及“替代激活”的M2型,活化为M1型时会促进炎症反应,导致组织损伤,而活化为M2型时则参与炎症消退、免疫调节和组织修复等[17]。M1型小胶质细胞活化主要产生TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等促炎细胞因子,而M2型小胶质细胞则主要表达Arg1、CD206等抗炎细胞因子[18]。iNOS、Arg1是代表M1、M2型小胶质细胞的经典标志物[19]。为了进一步探究雷公藤红素对小胶质细胞极化的影响,我们用Western blot分别检测小鼠视网膜iNOS、 Arg1蛋白表达水平。结果显示,免疫后第14天,iNOS、Arg1蛋白表达水平均升高;雷公藤红素干预后,iNOS表达水平降低,而Arg1蛋白表达无明显改变。同时,qRT-PCR检测结果显示,雷公藤红素干预后,TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均明显降低。这表明雷公藤红素可抑制M1型小胶质细胞活化及其相关炎症因子表达。

本研究尚存在一些不足,如我们只探究了雷公藤红素对EAU小鼠体内小胶质细胞活化的影响,而其在体外对小胶质细胞活化的影响未曾探究。另外,还需探讨梯度浓度雷公藤红素干预对于EAU的治疗作用,发掘安全有效的最低药物浓度。虽然雷公藤红素在EAU治疗中表现出显著效果,但由于其水溶性较差等原因,生物利用度有限,这会限制其在临床中的应用。