炎症在糖尿病视网膜病变中的作用：发病机制及治疗策略△

张敬法

糖尿病视网膜病变(DR)是世界卫生组织关注的三大重要致盲眼病之一,也是工作年龄人群视力受损的主要原因。当前对DR病理学机制的认识包括微血管病变、神经元病变以及中低度炎症反应(也称为“微炎症”)[1]。微炎症是指低度背景炎症,DR也被认为是一种慢性微炎症性疾病。炎症贯穿DR发病全过程,其表现包括患者全身和眼局部炎症相关分子表达的增加,如C反应蛋白(CRP)升高、中性粒细胞计数增加、以及眼内炎症生物标志物表达增加等[2-3]。炎症既包括炎症相关细胞(如白细胞、单核-巨噬细胞、小胶质细胞等),也包括炎症相关因子[如CRP、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等]。在糖尿病患者的玻璃体中,炎症因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平显著升高[4]。此外,高血糖还诱导视网膜内炎症细胞活化,如小胶质细胞活化和免疫细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等)浸润。在DR动物模型和临床DR患者中,血管内皮细胞上调表达介导白细胞黏附的分子,导致白细胞在视网膜和脉络膜微循环中滞留[5]。以上研究结果表明,DR是一种慢性炎症性疾病[6]。DR的炎症病因学特点是促炎因子水平增加、细胞炎症过程激活以及由此导致的血-视网膜屏障(BRB)破坏、黄斑水肿和视网膜神经元的损伤[6-7]。参与促炎介质产生的细胞包括内皮细胞、Müller细胞、小胶质细胞和浸润的单核-巨噬细胞等。这些炎症介质诱导的BRB破坏会加剧白细胞浸润,从而产生更多的细胞因子、趋化因子,导致BRB破坏的进一步恶化。本文从免疫角度、炎症相关细胞活化、炎症相关因子表达上调等方面探讨炎症在DR中的作用,同时提出抗炎治疗DR的策略,以期阐述炎症在DR中的作用及抗炎治疗。

1 炎症导致BRB破坏和视网膜神经元死亡

慢性低度炎症存在于DR的不同阶段。炎症是造成视网膜脉管系统损伤的原因,例如,视网膜血管通透性增加和新血管形成[8]。炎症因子增加诱导白细胞活化和迁移以及白细胞瘀滞,随后导致毛细血管闭塞、视网膜无灌注和缺氧,并由此产生的内皮细胞损伤导致BRB破坏、视网膜水肿、微动脉瘤、出血和渗出[1,8]。而活化的白细胞,特别是单核-巨噬细胞,释放各种炎症因子,进一步损伤内皮细胞,导致紧密连接下调和BRB破坏。活化的白细胞通过整合素与内皮细胞表面的细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)相互作用,导致白细胞瘀滞[9]。DR中,光感受器细胞产生的炎性因子导致BRB破坏和内皮细胞死亡[10]。除BRB破坏外,研究表明,Müller细胞来源的IL-17A在DR动物模型中表达上调,促进视网膜节细胞死亡[11]。

2 先天性免疫和适应性免疫活化参与DR发病

作为一种免疫特权组织,视网膜受到高度复杂、精密系统的保护,以免受全身免疫攻击。越来越多的证据表明,免疫机制在DR的发病中发挥着重要作用[12-13]。例如,DR中的BRB破坏是视网膜炎症发生的先决条件。在DR中,内皮细胞代谢紊乱可能导致血管功能障碍以及内皮细胞和视网膜色素上皮(RPE)细胞之间紧密连接的破坏。循环免疫细胞,包括中性粒细胞和单核细胞被激活,导致白细胞黏附、瘀滞和迁移至视网膜实质的白细胞增加[12]。BRB破坏还会导致血清蛋白(包括免疫球蛋白和补体蛋白)渗漏到视网膜间质组织中。

免疫系统由先天免疫和适应性免疫组成。先天免疫在糖尿病并发症发展中的作用已得到广泛研究[12-13]。先天免疫可保护宿主免受外源病原体(如病原体相关分子模式,PAMP)和内源危险分子(称为损伤相关分子模式,DAMP)的损伤。免疫细胞启动快速防御和延迟的细胞反应[12,14]。识别PAMP/DAMP的常见模式识别受体(PRR)包括Toll样受体(TLR)、C型凝集素受体、晚期糖基化终末产物受体、NOD样受体(NLR)和RIG样受体等[14]。先天免疫系统提供了针对DAMP的第一道防线。NLRP3是炎性小体的一个组成部分,在先天免疫中发挥着关键作用。NLRP3炎性小体是一种多聚蛋白复合物,可引发炎症形式的细胞死亡,并触发促炎细胞因子IL-1β和IL-18的释放。

据报道,先天免疫失调与炎症反应增加有关,从而导致DR进展[12]。NLRP3炎性小体的激活可能导致DR中黄斑水肿和血管渗漏的加重。在糖尿病期间,代谢紊乱会触发视网膜中DAMP的释放[12]。受损细胞释放的高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种DNA结合蛋白,能够与其受体结合,包括TLR2、TLR4、TLR9和晚期糖基化终末产物,然后激活 NLRP3 炎性小体。在炎症条件下,细胞外ATP通过P2X7受体介导NLRP3炎性小体激活[15]。总体而言,NLRP3炎性小体的激活会导致依赖caspase-1的IL-1β和IL-18产生,从而导致细胞焦亡[16]。几种NLRP3抑制剂已被研究用于治疗DR。例如,Zhang等[17]研究表明,NLRP3抑制剂Mcc950通过下调Nek7-NLRP3通路,对高糖诱导人视网膜内皮细胞的炎症反应具有抑制作用;Trotta等[18]研究表明,β-羟基丁酸激活羟基羧酸受体2(HCA2)通过减少 NLRP3 炎性小体激活来抑制糖尿病对视网膜的损伤。

有人提出自身免疫是DR疾病进展的驱动因素。在DR患者血浆中检测到多种自身抗体,包括抗醛缩酶抗体和抗周细胞抗体,表明自身免疫与DR相关;针对视网膜周细胞的自身抗体可能通过经典途径介导的补体激活诱导血管损伤[19]。在DR患者中检测到视网膜缺氧可能会诱导周细胞表达II型胶原蛋白,从而产生针对II型胶原蛋白的自身抗体[20]。由于BRB破坏,血清中的抗II型胶原蛋白抗体与视网膜血管周围的II型胶原蛋白接触。视网膜血管周细胞和II型胶原蛋白的持续损失可能导致免疫反应部位从视网膜转移到II型胶原蛋白含量丰富的玻璃体和玻璃体视网膜界面。除了自身免疫之外,还观察到循环T淋巴细胞参与白细胞瘀滞,T淋巴细胞的参与和激活意味着适应性免疫在DR发展中的作用[21]。总体而言,先天免疫的激活很可能导致了DR的发生,而适应性免疫可能在疾病的后续进展中发挥作用。

3 炎症细胞活化参与DR发病

炎症细胞活化参与了DR的发生与发展。炎症相关细胞既可来自血液系统,如白细胞、单核-巨噬细胞等,也可来自视网膜内,如小胶质细胞、Müller细胞、血管内皮细胞等。活化的内皮细胞、小胶质细胞、浸润性单核细胞/巨噬细胞和Müller细胞等被认为是视网膜促炎细胞因子的主要来源。

3.1 白细胞黏附和白细胞瘀滞

白细胞黏附和白细胞瘀滞是DR发展过程中微血管系统炎症表现的重要早期标志。DR的炎症本质始于白细胞与血管内皮的黏附(白细胞-内皮黏附),通常发生在DR的早期阶段。在对糖尿病患者遗体捐献者的尸检中,Lutty等[22]研究发现,糖尿病患者脉络膜和视网膜中的中性粒细胞数量显著增加。白细胞黏附导致血管内皮细胞间紧密连接的破坏和下调,并导致BRB破坏。黏附的白细胞可以阻塞视网膜毛细血管,参与毛细血管无灌注区的形成和发展。白细胞黏附是由白细胞和内皮细胞表面表达的黏附分子介导的,例如内皮细胞表达的ICAM-1与白细胞表达的β2整合素结合。β2整合素是异二聚体受体,由可变α亚基(CD11a-CD11d)和恒定β2(CD18)亚基组成,其中CD18对于中性粒细胞与内皮细胞的牢固附着至关重要[23]。β2整合素包括淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1、CD11a/CD18、αLβ2)、巨噬细胞1抗原(Mac-1、CD11b/CD18)、p150/95(CD11c/CD18)和CD11d/CD18,介导白细胞黏附、吞噬、细胞骨架重构和细胞信号转导。通过与LFA-1的β2整合素结合,ICAM-1激活关键的黏附信号通路途径,导致炎症相关细胞因子上调,促进视网膜炎症级联反应[24]。除了ICAM-1/β2整合素相互作用外,其他分子也介导白细胞黏附,如内皮细胞表达的VCAM-1和白细胞表达的极晚期抗原4(VLA-4)相互作用。

在DR中,白细胞黏附与毛细血管内皮细胞损伤和一系列的微血管病变有关,如血管渗漏、BRB破坏、血管内皮细胞损伤/死亡、毛细血管无灌注区形成等[25]。在糖尿病动物模型中,糖尿病诱导后不到3 d即可观察到视网膜白细胞黏附,并且在时间和空间上与毛细血管无灌注和BRB破坏相关。事实上,糖尿病的早期视网膜微血管改变是由低度、持续的白细胞激活引起的,这是白细胞与内皮细胞相互作用的结果。发病早期,视网膜毛细血管功能尚能得以代偿和维持。逐渐地,这种功能受到阻碍,血管内白细胞瘀滞变得不可逆转,随后出现血管渗漏和视网膜缺血。值得注意的是,白细胞瘀滞的增加与糖尿病代谢异常的增加是平行的[26]。后者会导致内皮细胞表面覆盖的成分损失,例如富含内皮透明质酸的糖萼,导致DR后期毛细血管密度降低和无细胞毛细血管增加[27]。

尽管人们普遍认为白细胞黏附和白细胞瘀滞在诱发DR慢性、低度炎症方面发挥着关键作用,但van der Wijk等[28]却提出了不同的观点,认为白细胞瘀滞的增加似乎是非特异性内皮细胞功能障碍的结果,而不是DR发展中关键的特定步骤,白细胞瘀滞可能是DR发病过程中的附带现象或继发效应。因此,白细胞瘀滞和低度炎症在DR发生与发展中的具体作用需要进一步研究。

激活白细胞并增强白细胞-内皮细胞相互作用的潜在分子机制可能是早期DR的治疗靶点,例如,抑制白细胞-内皮细胞相互作用可以减少视网膜白细胞瘀滞,减少BRB破坏并减轻黄斑水肿[29]。

3.2 巨噬细胞浸润

在糖尿病病程中,中性粒细胞和巨噬细胞等循环免疫细胞可能会浸润视网膜。浸润的免疫细胞与激活的小胶质细胞一起可能导致视网膜病变[12]。据报道,增生型DR(PDR)患者玻璃体和纤维血管膜中的M2巨噬细胞增多[30]。M2巨噬细胞密度增加与高水平的IL-11、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和可溶性CD163相关[31]。M2巨噬细胞促进血管生成和纤维化,先天免疫失调可能会加剧和延长这种情况[12]。随着BRB的破坏,补体、细胞因子和趋化因子等血清蛋白可能会渗入视网膜组织,加重组织损伤。已知补体激活失调与DR相关,并且全身补体激活与DR的进展呈正相关[32]。在2型糖尿病患者的视网膜血管中可以检测到膜攻击复合物(MAC)沉积增加以及CD55和CD59显著减少[33]。在PDR患者的玻璃体内检测到C5a、C3和补体因子I(CFI)增加[34]。

3.3 小胶质细胞的活化

小胶质细胞是视网膜内主要的常驻免疫细胞类型,构成了视网膜中神经胶质细胞的关键群体。视网膜中小胶质细胞的功能相当于组织中的巨噬细胞,是视网膜微环境的传感器,对各种损伤做出快速反应,在形态和功能上转变为具有“阿米巴”形态的反应性吞噬细胞。小胶质细胞是正常视网膜生长、免疫系统功能、神经发生和突触修剪所必需的。小胶质细胞与神经元、内皮细胞和其他神经胶质细胞相互作用,控制血管形成并参与衰老和视网膜功能。小胶质细胞分泌生长因子、细胞因子以及神经保护和抗炎介质;在视网膜发育中,小胶质细胞主要位于视网膜内层,包括神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层和外丛状层[35]。在视网膜中,小胶质细胞获得高度分枝的形态,具有小细胞体和可能跨越内核层和外核层的长细胞突起。分枝的小胶质细胞形成一个有组织的区域网络,通过不断移动它们的突起来扫描每个单细胞周围特定区域中的视网膜神经元表面[35]。

我们近期研究发现了DR动物模型视网膜中小胶质细胞的活化[36-37]。在糖尿病大鼠中,小胶质细胞被激活,细胞增殖增强、数量增加,从视网膜内层到外层的迁移增强,甚至迁移到视网膜下腔和RPE层。活化的小胶质细胞与视网膜毛细血管紧密接触,尤其是深层毛细血管丛。进一步研究表明,活化的小胶质细胞可穿透毛细血管的基底膜并吞噬内皮细胞,导致BRB破坏、渗漏增加和无细胞性毛细血管(acellular capillary)的形成;小胶质细胞对内皮细胞的吞噬作用与其细胞内Src/Akt/Cofilin通路信号转导减弱有关[36]。除了吞噬作用外,活化的小胶质细胞还可以释放多种炎性因子加重视网膜神经元及血管细胞的损伤。如活化的小胶质细胞释放TNF-α介导视网膜神经节细胞的非细胞自主细胞死亡[38]。活化的小胶质细胞释放TNF-α、IL-1β和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)等损伤视网膜周细胞和血管内皮细胞,加重BRB破坏[39]。小胶质细胞的活化与视网膜神经元凋亡导致fractalkine(FKN,一种小胶质细胞激活抑制剂)表达减少有关[37]。在实验性和临床DR中,可观察到神经元变性和突触连接丧失[40]。视网膜神经元通过CD200-CD200R和CX3CL1-CX3CR1途径控制小胶质细胞的激活。神经元变性可能导致这些通路功能障碍,导致小胶质细胞激活不受控制[41]。由于神经元凋亡的增加,导致FKN表达减少,从而对小胶质细胞的抑制作用不足,导致小胶质细胞活化。在概念验证中发现,在糖尿病大鼠模型中,玻璃体内注射FKN可减少视网膜炎症因子的表达以及细胞内活性氧的产生[37]。

Goto Kakizaki大鼠是一种广泛使用的自发性2型糖尿病模型,是通过选择性繁殖Wistar大鼠而产生的[42]。在Goto Kakizaki大鼠中,随着糖尿病的进展,活化的小胶质细胞/巨噬细胞逐渐在视网膜下腔积聚。在长达5个月的时间里,视网膜下腔中可检测到稀疏的小胶质细胞/巨噬细胞,以及RPE细胞中的大量微孔,从而允许炎症细胞在视网膜和脉络膜之间迁移。患糖尿病12个月后,在视网膜外层和视网膜下腔中发现大量小胶质细胞。此时,RPE细胞层中的孔密度显著降低,视网膜下腔中小胶质细胞/巨噬细胞积聚,同时RPE细胞空泡化、功能障碍和光感受器外节解体[43]。临床上,通过频域光相干断层扫描(SD-OCT)观察,糖尿病患者视网膜中活化的小胶质细胞聚集体显示为高反射点或病灶(HRD/HRF)。在糖尿病黄斑水肿(DME)患者中,房水中可溶性CD14(sCD14,小胶质细胞/巨噬细胞释放的细胞因子)水平与SD-OCT观察到的HRF数量呈正相关,表明小胶质细胞/巨噬细胞等炎症细胞与DME的发病机制密切相关[44]。

3.4 Müller细胞活化

Müller细胞是多种炎性介质的重要来源,在炎症过程的起始中发挥着关键作用[45]。活化的Müller细胞会合成急性期反应蛋白以及许多生长因子和细胞因子[46]。一项对糖尿病大鼠Müller细胞的基因表达研究表明,1/3的糖尿病诱导基因与炎症有关,包括补体因子、VEGF、ICAM-1和IL-1β[47]。在高血糖状态下,Müller细胞被激活并释放许多细胞因子,包括VEGF、色素上皮衍生因子(PEDF)、IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1[48]。有证据表明,在糖尿病患者玻璃体中发现的大多数生长因子、细胞因子和趋化因子是由活化的Müller细胞产生的[49]。例如,CD40,一种肿瘤坏死因子受体超家族成员,在各种造血和非造血细胞上表达,也由视网膜内皮细胞和Müller细胞表达[50]。CD40与其配体CD154的相互作用调节细胞和体液免疫,并通过激活巨噬细胞/小胶质细胞增强炎症;在Müller细胞特异表达CD40的糖尿病小鼠中发现了炎症相关的病理事件,包括白细胞瘀滞和毛细血管变性,Müller细胞通过CD40-ATP-P2X7通路特异性地表达促炎因子,包括TNF-α、IL-1β、ICAM-1和iNOS2[50]。

3.5 星形胶质细胞释放炎性因子

与Müller细胞类似,星形胶质细胞接触视网膜血管和神经元,在维持BRB中发挥关键作用[51]。与Müller细胞相比,星形胶质细胞在很大程度上仅限于视网膜神经纤维层和节细胞层,而Müller细胞与所有类型的视网膜神经元相连。视网膜星形胶质细胞与血管密切相关,并参与DR中BRB的破坏。在糖尿病早期,有证据表明,星形胶质细胞被激活并产生多种促炎细胞因子,如IL-6、IL1β、IL-8、环氧合酶(COX)-2、TGF-β、表皮生长因子、巨噬细胞炎症蛋白2α和VEGF[52]。反应性星形胶质细胞也可以分泌趋化因子,募集小胶质细胞、单核细胞/巨噬细胞和T细胞,放大炎症反应[53]。

4 炎性因子参与DR的发生与发展

除了炎症细胞的激活外,炎性因子、趋化因子、补体等表达上调并参与DR的发生与发展。大量研究表明,糖尿病患者眼内液中炎性因子的水平升高,包括低氧诱导因子1α(HIF-1α)、VEGF、胎盘生长因子(PlGF)、胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子、PEDF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、单核细胞趋化蛋白1/2(MCP-1/2)、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、干扰素-γ、干扰素γ诱导蛋白10、补体成分3a和5a、CD40等[54]。在DME患者中,玻璃体中炎性细胞因子的水平,如VEGF、ICAM-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1等显著升高,提示炎性因子参与了DME的发病[55]。

4.1 HIF-1α

在DR中,HIF-1α的上调会导致多种缺氧调节基因产物的升高,包括VEGF、血管生成素-2(Ang-2)、IL-6、TNF-α和血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶等。在缺氧期间,VEGF-A的表达通过HIF-1α在转录水平上受到调节。相反,VEGF-A的基础水平不依赖于HIF-1α调控,而是依赖于翻译后水平的PKCβ/HuR级联调控[56]。近期使用Ins2Akita糖尿病小鼠模型的研究揭示了糖尿病视网膜中HIF-1α的时间依赖性调节事件：HIF-1α蛋白在第9周(DR早期)显著增加,然后逐渐下降至基线水平;另一方面,PKCβ/HuR的蛋白水平在46周时显著上升,在DR后期维持VEGF-A水平;在DR中,早期升高的HIF-1α蛋白水平可能有助于预防神经退行性病变,因为它似乎有利于VEGF-A同工型(如VEGF120/121)的转录,而不是VEGF164(相当于人VEGF165);与VEGF-A相比,这些亚型具有神经保护、抗血管生成和抗炎作用;条件性HIF-1α敲除小鼠表明Müller细胞来源的HIF-1α是视网膜血管生成和炎症的关键介质[57]。因此,Müller细胞来源的HIF-1α是糖尿病视网膜炎症抑制的潜在治疗靶点。

4.2 VEGF

VEGF-A被认为是DR进展的核心参与者[58]。VEGF-A在缺血诱导和炎症下游途径中具有多种功能[59]。结合VEGF受体(VEGFR)后,VEGF-A主要通过磷酸肌醇3激酶-Akt/蛋白激酶B途径促进细胞存活。VEGF/VEGFR还会激活PKC通路,从而促进细胞增殖[60]。此外,VEGF/VEGFR刺激丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路,参与内皮细胞通透性增强和血管生成。

因此,VEGF-A具有多种作用。一方面,在糖尿病患者视网膜中,视网膜缺血缺氧导致Müller细胞、神经节细胞和活化的白细胞产生大量的VEGF,加剧白细胞的黏附和瘀滞[61];另一方面,聚集的白细胞可以阻断VEGF与其受体的结合,从而可能导致视网膜再灌注损伤[62]。

总体而言,VEGF-A是DR治疗的主要靶点。靶向VEGF-A可采用多种方法,包括控制上游HIF-1α和PKCβ/HuR通路、直接中和VEGF-A、阻断VEGF/VEGFR轴以及调节VEGF-A下游通路。然而,研究表明,38%的PDR患者眼内VEGF浓度较低,与非糖尿病的对照者相比差异无统计学意义,表明这些患者对抗VEGF治疗可能无反应。换句话说,这些患者的临床表现可能归因于非VEGF途径。DRCR.net Protocol T的事后分析结果表明,30%～66%的患者在常规抗VEGF治疗24周后,持续性黄斑水肿仍存在[63],提示除VEGF外,其他通路,特别是炎症相关通路,也可能参与了DME的发病机制[64]。

4.3 PlGF

PlGF属于VEGF家族成员,可调节一系列与VEGF-A不同的神经、神经胶质和血管细胞反应。由于PlGF选择性表达与病理性血管生成和炎症相关,因此阻断PlGF不会影响健康的脉管系统。PlGF的作用已在肿瘤生物学中得到广泛研究。最近,越来越多的临床前证据表明PlGF在视网膜疾病中可能发挥重要作用[65]。PlGF主要与VEGFR-1结合,VEGFR-1主要表达于血管内皮细胞、造血细胞、单核细胞/巨噬细胞和周细胞;与VEGFR-1结合后,PlGF可以影响内皮细胞的生长、迁移和存活[65]。

在缺血应激下,PlGF可以激活单核细胞,增加促炎趋化因子(如IL-1β、IL-8和MCP-1)的表达[66]。在进行性视网膜缺血相关的DR患者中,PlGF在房水、玻璃体、视网膜以及视网膜细胞(例如内皮细胞、周细胞)中表达上调[67]。但PlGF在视网膜血管疾病病理性血管生成中的确切作用以及PlGF特异性抑制对DR患者是否获益仍有待探索。

4.4 ICAM-1

高血糖导致视网膜ICAM-1表达上调,并伴有白细胞数量显著增加,引起毛细血管阻塞、内皮细胞损伤和血管渗漏[68]。糖尿病患者和糖尿病动物模型的视网膜和脉络膜血管系统中ICAM-1表达上调[29]。在DME患者中,玻璃体可溶性ICAM-1表达显著增加,并与黄斑中心凹厚度(CMT)增加相关[25]。最近的一项荟萃分析结果表明,ICAM-1在DR患者中普遍升高,其升高水平与DR严重程度相关[6]。在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中,视网膜血管渗漏和无灌注区在时间和空间上与视网膜白细胞瘀滞相关;此外,ICAM-1抑制可防止糖尿病视网膜白细胞瘀滞和血管渗漏,表明ICAM-1参与DR的炎症病因;用单克隆抗体或基因敲除阻断ICAM-1功能可减少白细胞瘀滞、血管渗漏和内皮细胞死亡,同时维持BRB的完整性[29]。

4.5 MCP-1

MCP-1,也称为CCL2,是CC趋化因子家族的成员,在DR炎症中发挥着至关重要的作用。例如,糖尿病眼中,Müller细胞在房水和玻璃体中产生大量MCP-1。MCP-1是一种高效趋化因子,可刺激单核细胞和巨噬细胞的募集和激活。MCP-1刺激单核细胞和巨噬细胞产生超氧化物、炎症因子和其他介质[55]。此外,MCP-1还促进纤维化和血管生成[69]。MCP-1表达受核因子κB(NF-κB)的调节。MCP-1可以增加VEGF表达,促进新生血管形成。在PDR和增生性玻璃体视网膜病变患者的肌成纤维细胞和血管内皮细胞膜中检测到MCP-1表达[70]。在糖尿病患者视网膜中,视网膜神经元是MCP-1产生的主要来源,MCP-1随着疾病进展而增加,随后激活视网膜小胶质细胞[71]。

在糖尿病患者中,RPE细胞、神经胶质细胞和内皮细胞调节MCP-1的产生。MCP-1通过其受体CC趋化因子受体2型(CCR2)发挥其功能。单核细胞和巨噬细胞表达CCR2,并参与DR的炎症事件[72]。多项研究表明,DR患者玻璃体中的MCP-1水平高于血清中的水平,表明MCP-1是眼局部表达并产生的[73]。此外,玻璃体中MCP-1的表达水平与DR的严重程度呈正相关[74]。总体而言,MCP-1通过单核细胞和巨噬细胞的诱导、激活和募集在血管炎症中发挥着关键作用。在抑制MCP-1抗炎治疗DR中,可能策略包括MCP-1基因抑制、NF-κB抑制和MCP-1-CCR轴抑制[55]。

4.6 TNF-α

研究发现,与非增生型DR(NPDR)患者相比,PDR患者的玻璃体和血清中TNF-α表达上调[75]。TNF-α是促进白细胞黏附导致视网膜血管炎症的引发剂,在DR中,TNF-α还介导NF-κB激活。在糖尿病大鼠视网膜中,TNF-α导致显著的周细胞丢失和毛细血管变性[76]。相反,TNF-α基因缺陷小鼠表现出白细胞瘀滞减轻、血管渗漏减少以及周细胞和内皮细胞损失减少[77]。玻璃体内注射TNF-α抑制剂可以减轻糖尿病动物模型视网膜毛细血管变性和周细胞损失,从而防止BRB破坏[78]。TNF-α抑制剂治疗DR的可能应用需要进一步研究。

4.7 IL-1β

IL-1β主要由巨噬细胞产生。IL-1β被裂解的caspase-1激活,促进NF-κB转录并增加IL-6和IL-8的表达。因此,caspase-1活性的增加促进DR炎症的发展。在氧诱导视网膜病变的小鼠模型中,IL-1β活性增加,而IL-18活性降低,从而促进新生血管形成;通过使用MCC950(NLRP3的核苷酸结合域抑制剂),可以逆转IL-1β/IL-18激活模式,从而抑制视网膜新生血管形成,减少无细胞毛细血管数量和视网膜血管渗漏[79]。此外,抗氧化剂或caspase-1抑制剂可以防止视网膜中IL-1β的增加,并减轻这些动物视网膜毛细血管的变性;IL-1β受体的缺失可以防止糖尿病视网膜毛细血管变性[80]。临床适用的IL-1β抑制剂值得进一步研究。

4.8 IL-6

IL-6由多种视网膜细胞产生并参与炎症,在DR早期事件中充当局部信号增强剂。这些早期事件的特点是白细胞瘀滞增加和炎症介质(如IL-6和 TNF-α)的存在,这些介质与内皮细胞损伤和血管功能障碍直接相关[6]。荟萃分析结果显示,DR患者的IL-6水平相对于对照组显著升高;亚组分析进一步显示,PDR患者IL-6水平高于NPDR患者,表明IL-6升高也参与了DR的进展[81]。

对伴有中心凹下神经视网膜脱离(SND)型DME患者玻璃体内细胞因子浓度的分析结果显示,玻璃体内VEGF、IL-6和IL-8浓度升高,其中,升高的IL-6与SND的存在密切相关,表明SND型的DME存在炎症病因[82]。

4.9 Ang-2

血管生成素/酪氨酸激酶与免疫球蛋白和表皮生长因子同源结构域(Ang/Tie)通路在维持血管稳定性、血管生成和血管通透性方面发挥着重要作用[83]。Ang-2不仅是一种促血管生成因子,还是一种炎症因子。Ang-2主要由内皮细胞产生并储存在Weibel-Palade小体中,受到刺激后Ang-2迅速释放。Ang-2水平在多种疾病条件下表达上调,包括缺氧和氧化应激。Ang-2的作用方式包括自分泌和旁分泌方式,自分泌Ang-2信号转导诱导黏附分子和血管渗漏,而旁分泌信号由单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞接收。受到刺激后,先天免疫细胞会增加对血管壁的黏附力,以β2整合素依赖性方式介导,从而导致炎症[84]。

法瑞西单抗(faricimab)也称为RG7716,是一种双特异性抗体,可同时结合VEGF-A和Ang-2。DME(YOSEMITE NCT03622580和RHINE NCT03622593)的3期临床试验结果显示,使用法瑞西单抗治疗后,患者视力明显增强,解剖结构也得到改善。法瑞西单抗对部分患者的个性化治疗间隔可以延长至16周[85]。法瑞西单抗于2022年1月首次被FDA批准用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)和DME[86]。

5 DR的抗炎治疗

由于炎症在DR及DME的发病机制中发挥至关重要的作用,因此拮抗或抑制炎症可以成为治疗DR和DME的方法之一[1]。当前在DME的治疗中,抗VEGF药物作为治疗DME的一线疗法。据DRCR.net Protocol T报道,尽管VEGF抑制剂具有很高的疗效,但仍有30%～67%的患者在接受抗VEGF药物治疗半年后,黄斑水肿持续性存在[63]。临床前和临床研究表明,除VEGF外,其他因素(包括炎症)在DR和DME的进展中也发挥着重要作用。因此,采用抗炎治疗DR的替代疗法具有一定的疗效。

5.1 皮质类固醇

由于其抗炎和抗血管生成特性,皮质类固醇已被证明有益于治疗DR和DME。例如,玻璃体内注射缓释地塞米松(傲迪适,Ozurdex,Allergen)在治疗DME方面安全有效,能提升患者视力、消退黄斑水肿并减少眼内炎症介质,包括VEGF、MCP-1和IL-6等[87]。玻璃体内注射皮质类固醇在糖尿病动物模型中显示出类似的效果。在糖尿病大鼠中,给予类固醇后,白细胞瘀滞及血管渗漏显著减少[88]。在Ozurdex MEAD研究组试验中,两项大型双盲研究评估了Ozurdex(0.35 mg和0.70 mg)的安全性和有效性,两种剂量的Ozurdex植入物均达到了改善视力的主要疗效终点,且安全性可接受[89]。

FAME研究评估了氟轻松醋酸酯玻璃体植入物(Iluvien,Alimera Sciences,Alpharetta,GA,美国)的长期疗效和安全性。Iluvien植入物释放0.2 μg·d-1(低剂量)或0.5 μg·d-1(高剂量)氟轻松,用于治疗DME。Iluvein植入物在长达3年的时间内为DME患者提供了显著的视觉获益,特别是那些对其他治疗(如抗VEGF治疗)应答不佳的患者[90]。

一些研究证明了皮质类固醇和抗VEGF药物联合治疗对难治性DME患者具有优势[91-93]。Busch等[92]研究表明,注射后3个月对抗VEGF耐药的DME患者可能会受益于在治疗早期改用地塞米松植入物。在一项初步研究中,玻璃体内联合注射贝伐单抗和曲安西龙可以提高一些患有严重弥漫性DME患者的视力并减少CMT[93]。在一项非随机回顾性干预研究中,Sadhukhan等[91]在难治性DME患者中,眼内首次注射雷珠单抗联合地塞米松植入物,结果显示,30名患者中有21名显示出令人鼓舞的结果,患者视力得到改善,CMT减少。

其他药物,如二氟泼尼酯(Difluprednate)是一种抗炎类固醇,可有效治疗前葡萄膜炎、术后眼部炎症和疼痛[94]。二氟泼尼酯眼用乳剂(0.5 g·L-1,Durezol,Sirion Therapeutics Inc.,美国)可有效减少玻璃体切割术后难治性DME和弥漫性DME,无需手术干预[95]。在另一项临床研究中,20名持续性DME患者接受二氟泼尼酯眼用乳剂治疗后,视力得到改善,视网膜厚度降低[96]。外用地塞米松-环糊精滴眼液(dexamethasone-cyclodextrin eye drops)耐受性良好,可降低CMT,提高DME患者的视力[97]。在一项随机对照试验中,局部使用15 g·L-1地塞米松γ-环糊精纳米颗粒滴眼液可显著提高DME患者的视力并降低黄斑厚度[98]。然而,眼压升高的潜在副作用限制了类固醇作为DME一线治疗的使用。

5.2 非甾体抗炎药

非甾体抗炎药通过调节前列腺素依赖性途径来抑制COX系统,该酶系统是眼部炎症的重要介质。COX-2在DR炎症中发挥重要作用,因此非甾体抗炎药可能具有治疗DR的潜力。COX-2的表达及其产物,如前列腺素E2(PGE2),在糖尿病大鼠视网膜和高糖培养的视网膜Müller细胞系中显著增加,COX-2抑制可减少糖尿病大鼠视网膜中PGE2的产生,并减少ICAM-1和TNF-α的表达[99]。据报道,非甾体抗炎药对DME有效,但结果各不相同。

溴芬酸(bromfenac)主要作用于COX-2[100],奈帕芬胺(nepafenac)是一种前药,通过其活性代谢物氨芬酸抑制COX-1和COX-2的活性[101]。在一项初步研究中,局部用溴芬酸可显著降低DME患者的CMT,但对视力没有明显提高[102]。在5例患者的6眼中测试了外用1 g·L-1奈帕芬胺治疗DME的安全性和有效性,结果表明,局部奈帕芬胺治疗可改善患者视力并减少视网膜厚度[103]。据报道,在6周的随访期间,局部奈帕芬胺对于减轻轻度DR患者视网膜小动脉直径和减少CMT具有显著效果[104]。糖尿病患者超声乳化术后局部使用奈帕芬胺辅助治疗可有效预防黄斑水肿,在一项前瞻性研究中,糖尿病患者患有明显白内障且无DME行超声乳化吸除联合人工晶状体(IOL)植入术后被随机分配接受术后局部奈帕芬胺、术中玻璃体内注射雷珠单抗,或不接受预防性治疗(对照组),术后3个月随访时,与对照组相比,局部奈帕芬胺组患者的视力显著改善,CMT减少,奈帕芬胺治疗组和雷珠单抗治疗组患者之间视力和CMT差异均无统计学意义,表明术后局部使用奈帕芬胺可能是糖尿病患者超声乳化吸除术的有效辅助疗法,可预防黄斑水肿[105]。

5.3 血管黏附蛋白-1抑制剂

血管黏附蛋白-1(VAP-1),也称为含铜胺氧化酶3或氨基脲敏感胺氧化酶,是一种膜结合黏附蛋白,可促进白细胞与内皮细胞的结合及其随后迁移至炎症部位[106]。VAP-1是一种双功能蛋白,它可以催化伯胺的脱氨基作用,还参与过氧化氢、醛和晚期糖基化终末产物(AGE)的产生[107]。前期研究结果表明,PDR患者玻璃体中可溶性VAP-1水平高于非糖尿病患者,介导炎症和氧化应激[108]。

视网膜内皮细胞上的VAP-1介导白细胞的滚动、黏附、迁移和白细胞瘀滞,VAP-1参与白细胞募集,在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中,VAP-1的特异性抑制剂(UV-002)降低了白细胞迁移率,表明抑制VAP-1可能具有治疗DR的潜力[106]。VAP-1的过表达会加剧氧化应激并调节多种炎症介质[107]。在激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)模型中,抑制VAP-1表达后,CNV形成被显著抑制,且巨噬细胞浸润到CNV病灶中的量显著减少[109]。此外,抑制VAP-1会降低ICAM-1和MCP-1的表达。在视网膜激光光凝术后的小鼠中,RTU-1096(一种VAP-1抑制剂)可减少眼内白细胞的募集和ICAM-1的表达,从而导致过氧化氢水平降低[110]。因此,VAP-1的抑制可能是预防DR患者视网膜光凝继发黄斑水肿的潜在治疗策略。在糖尿病动物模型中,视网膜电图和组织病理学研究证明了VAP-1抑制对视网膜功能和结构的有益影响[111]。因此,VAP-1抑制可以作为治疗DR的辅助疗法。

ASP8232是一种特异性强的小分子VAP-1抑制剂。一项2期、随机、双盲、活性对照研究(VIDI研究,NCT02302079)评估了ASP8232治疗累及中心凹的DME的效果[112],原始数据显示,ASP8232几乎完全抑制血浆VAP-1活性,但对累及中心凹的DME患者的CMT没有影响。此外,与雷珠单抗联合治疗并没有为DME患者提供额外的益处。BI 1467335(也称为PXS-4728A)可抑制中性粒细胞束缚和滚动,减少小鼠模型中的炎症[113],ROBIN(NCT03238963)Phase 2a临床试验结果显示,BI 1467335达到主要安全终点,但无法证明明确的疗效信号(由于药物相互作用的风险而停止开发)。因此,VAP-1抑制剂的临床应用需要进一步研究。

5.4 IL-6/IL-6R抑制剂

IL-6由多种细胞产生。IL-6信号强化与慢性炎症相关的局部病理过程。一项荟萃分析结果表明,糖尿病患者的玻璃体和/或血清中通常检测到IL-6水平升高,并且与DR的严重程度相关[81]。在DR患者中,IL-6是视网膜血管炎症的主要介质之一。IL-6在DR启动BRB破坏中发挥着重要作用[114],因为,IL-6信号转导会扰乱视网膜内皮细胞的屏障功能,并通过下调紧密连接蛋白导致血管渗漏、BRB破坏。IL-6通过其膜结合的IL-6R信号转导被称为“经典信号转导”。重要的是,在不表达膜结合 IL-6R 的细胞中也可以通过可溶性IL-6R(sIL-6R)观察到IL-6信号转导,称为“反式信号转导”[115]。IL-6反式信号转导的下游后果导致人视网膜内皮细胞氧化应激、炎症和BRB破坏[116]。在早期DR小鼠模型中,抑制IL-6反式信号转导可显著减少糖尿病引起的全身和局部视网膜水平的氧化损伤。越来越多的证据表明,IL-6经典信号转导具有抗炎作用,而反式信号转导则诱导IL-6的促炎作用[117]。因此,抑制IL-6反式信号转导能够预防视网膜内皮细胞的炎症和内皮屏障破坏[116]。

当前针对IL-6信号通路的拮抗开发了较多的干预措施[118],包括抗IL-6抗体(如siltuximab、sirukumab、olokizumab和clazakizumab)、抗IL-6R抗体(如托珠单抗、sarilumab、satralizumab和vobarilizumab)、以及IL-6反式信号转导的选择性抑制剂[如sgp130Fc (olamkicept)]。抗IL-6和抗IL-6R策略可全局阻断IL-6信号转导,主要针对经典信号转导途径和反式信号转导途径。托珠单抗是一种抑制IL-6R的单克隆抗体,可用于治疗各种自身免疫和炎症性疾病,特别是类风湿性关节炎。因此,阻断IL-6和IL-6R可能是治疗DR的潜在方法。

5.5 TNF-α抑制剂

TNF-α是一种多效细胞因子,可在类风湿性关节炎、炎症性肠病、DR等炎症性疾病中诱导促炎和促血管生成[119]。TNF-α是一种炎症细胞因子,可促进黏附分子表达、白细胞募集和单核细胞趋化。研究发现,与对照组相比,糖尿病患者房水和玻璃体中的TNF-α有所增加[120]。一项荟萃分析结果显示,与健康人相比,糖尿病患者的血清TNF-α有所增加。血清TNF-α升高与DR的存在和严重程度相关[121]。靶向TNF-α可能为治疗DR和DME提供一种选择。在临床应用中,三种抗TNF-α单克隆抗体,即英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗,以及抗TNF-α融合蛋白依那西普对类风湿性关节炎几乎同样有效[119]。事实上,一项使用英夫利昔单抗在一组DME患者中实现解剖学和功能改善的临床研究是一项概念验证研究,佐证了TNF-α在DR中的致病作用,在对激光光凝无反应的DME患者中进行了测试的结果显示,静脉注射5 mg·kg-1英夫利昔单抗治疗后,患者视力和水肿有一定程度的改善[122]。

5.6 米诺环素

米诺环素是第二代半合成四环素,具有抗炎和神经保护作用,其抗炎作用与其抗菌作用无关。米诺环素对许多涉及小胶质细胞和炎症的神经变性动物模型有效。米诺环素生物利用度高,已用于多种动物模型,包括实验性DR、视网膜变性、内毒素引起的葡萄膜炎、视网膜脱离和青光眼等[123]。米诺环素可显著减轻炎症并防止脑缺血和光诱导的光感受器变性后的兴奋性神经元死亡[124]。米诺环素部分通过抑制小胶质细胞的增殖和活化来发挥其神经保护作用。在实验性DR模型中,米诺环素可降低炎症介质的表达、小胶质细胞激活和caspase-3激活[125]。米诺环素还被证明可以通过在亨廷顿病转基因小鼠模型中抑制caspase-1、caspase-3以及在脊髓损伤模型中抑制细胞色素c从线粒体中释放来发挥抗细胞凋亡作用[126]。在一项单中心、前瞻性、I/II期临床试验(NCT01120899)中,招募了5例患有累及中心凹的DME患者,他们每天两次口服米诺环素100 mg,持续6个月,结果表明,口服米诺环素改善了DME患者的视功能、黄斑水肿和血管渗漏,初步临床数据表明,口服米诺环素抑制小胶质细胞是一种针对DME炎症病因的可行策略[127]。

5.7 整合素拮抗剂

risuteganib是一种整合素拮抗剂(亦称为ALG-1001,Allegro Ophthalmics),是一种新型玻璃体内给药的合成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)寡肽,可有效结合和抑制四种整合素异二聚体,即αVβ3、αVβ5、α5β1和αMβ2,抑制与血管生成、炎症、血管通透性和细胞毒性调节相关细胞的相互作用;DEL MAR 2b 期试验使用risuteganib作为DME患者单次抗VEGF注射后的序贯治疗,与抗VEGF单药治疗相比,联合治疗可持续且同等地提高患者视力[128]。SB-267268(GlaxoSmithKline)是αvβ3和αvβ5整合素的小分子拮抗剂[129]。在体外研究中,与其他整合素αIIbβ3、α5β1和α3β1相比,SB-267268在与αvβ3和αvβ5受体结合方面具有1 000倍的选择性。在早产儿视网膜病变的动物模型中,SB-267268使病理性血管生成减少了50%,同时也减少了VEGF和VEGFR2的mRNA表达水平[129]。AXT-107(AsclepiX Therapeutics)靶向αvβ3和α5β1整合素,在Ang-2转基因小鼠模型和LPS诱导的炎症模型中,AXT-107具有抑制血管渗漏和炎症的作用[130]。抗CD49d(又称为整合素α4)中和抗体阻断VLA-4表达,可显著减弱糖尿病引起的白细胞瘀滞和血管渗漏[131]。此外,抗CD49d中和抗体降低了NF-κB活性以及VEGF和TNF-α的蛋白表达水平,表明白细胞募集在DR炎症通路中具有正反馈作用[132]。

5.8 免疫抑制剂

由于DR具有一些涉及先天免疫和适应性免疫的特征,因此值得研究治疗DR的免疫抑制或免疫调节疗法。包括皮质类固醇在内的各种免疫抑制剂已被证明可有效治疗DR,尤其是DME。玻璃体内注射甲氨蝶呤治疗对贝伐单抗无反应的持续性DME患者,16.6%的患眼出现了解剖学改善和视力显著改善[133]。西罗莫司(Rapamune,Wyeth-Ayerst,Madison,NJ)是一种有效的免疫抑制剂,可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,一种多功能丝氨酸-苏氨酸激酶)。西罗莫司已被证明可以抑制与DR发展相关的许多生长因子的产生、信号转导和活性。结膜下或玻璃体内注射西罗莫司制剂对DME患者似乎是安全的[134]。这些针对免疫调节的抗炎疗法前景广阔,值得进一步的临床试验。

5.9 其他潜在靶点

Canakinumab(诺华公司,巴塞尔,瑞士)是一种选择性IL-1β抗体,在辅助治疗PDR时,患者表现为黄斑水肿减轻、病情稳定,该药对患者的新血管形成没有影响[135]。而其他针对促炎因子的潜在疗法,如靶向ICAM-1、MCP-1、VLA-4等,值得在未来进行临床试验。在实验性糖尿病大鼠模型中,抗ICAM-1抗体可防止视网膜白细胞瘀滞并减轻血管渗漏[29]。SAR 1118是一种新型LFA-1小分子拮抗剂,是LFA-1与ICAM-1结合的直接竞争性拮抗剂,与LFA-1 CD11a亚基的I结构域结合[136]。局部给药SAR 1118可显著减少链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中的白细胞瘀滞和 BRB 破坏[137]。一项前瞻性、随机、双盲1b期试验表明,眼局部应用SAR 1118是安全的且耐受性良好,并证明了其在人眼眼前节治疗中具有良好的药代动力学[138]。然而,SAR 1118在玻璃体中的含量低于测试浓度的检测阈值,因此需要进一步研究增加其在眼后段的浓度及其对DR患者的疗效。

组蛋白脱乙酰酶,亦称为去乙酰化酶(SIRT),参与细胞衰老、细胞周期、代谢途径和DNA修复。在DR中,SIRT 1、3、5和6在炎症反应、氧化应激以及糖酵解和糖异生的激活中发挥调节作用。目前正在开发SIRT通路激活剂(如白藜芦醇、甘草甜素)来治疗DR中发生的炎症级联反应。因此,调节SIRT是一种值得期待的新的抗炎治疗方法[139]。

6 结束语

DR是一种中低度慢性炎症性疾病,涉及炎症细胞的活化、炎性因子的大量生成和表达等,炎症因素(炎症细胞和炎性因子)作用于整个视网膜中,会导致BRB破坏、视网膜神经元死亡,加重DR的发生与发展。当前,临床上对DME的治疗以眼内注射抗VEGF为主,但仍有部分患者对抗VEGF治疗不敏感、甚至不反应,提示其他因素,尤其是炎症因素也参与了DR的发病。今后有待于开发DR患者眼内炎症因素相关的检测,如眼内液的检测、多模影像如OCT对高反射点和SND的检测等,从而区分并判定炎症在DR和DME中的作用,针对DR的不同发病机制,尤其是抗炎治疗有待于开展个体化疗法,从而使患者获益。