虎杖中白藜芦醇提取工艺的优化及其抗氧化性

苏 东 海, 张 虎 成, 彭 坚, 杨 国 伟, 辛 秀 兰

( 1.北京电子科技职业学院 生物工程学院, 北京 100176;2.北京市经济管理学校 食品工程系, 北京 100036 )

0 引 言

过多接触紫外线辐射可引起皮肤晒伤、晒黑、皮肤光敏反应、皮肤光老化甚至皮肤癌等。研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等功效[1],对黑色素瘤增殖具有较好的抑制作用。白藜芦醇存在于花生、葡萄、虎杖等许多植物中,是植物受到生物或非生物胁迫时产生的一种植物抗毒素[2]。目前,从虎杖中提取白藜芦醇的方法包括超声提取法[3]、超临界CO2萃取法[4]、酶解法[5-6]、有机溶剂提取法[7]和微波萃取法[8]等,提取效率还有待进一步提升。本研究在单因素试验基础上,应用响应面法对虎杖中白藜芦醇的提取工艺条件进行优化,通过对DPPH、羟自由基清除能力的测定,以及提取物对紫外照射后成纤维细胞的SOD、CAT、GSH和MDA水平的影响,检验白藜芦醇的生物活性。

1 材 料

1.1 材料与仪器

虎杖;黑色素癌细胞A375,中国科学院细胞库;白藜芦醇标准品,上海金穗生物科技有限公司;DPPH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超氧自由基清除率检测试剂盒,北京盒子生工科技有限公司;噻唑蓝、二甲亚砜、PI碘化丙啶,北京默克有限公司;MDA、SOD、CAT、GSH检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒,碧云天生物技术有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 虎杖中提取白藜芦醇的单因素试验

分别采用不同超声功率、提取时间、乙醇体积分数、料液比进行单因素试验,研究不同因素对白藜芦醇提取率的影响。称取1.0 g虎杖粉末,乙醇体积分数75%,料液比1∶30,分别在超声功率120、210、300、390、480、570 W提取30 min。称取1.0 g虎杖粉末,乙醇体积分数75%,料液比1∶30,超声功率480 W,提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min。称取1.0 g虎杖粉末,料液比1∶30,超声功率480 W,提取时间30 min,分别配置45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液。称取1.0 g虎杖粉末,乙醇体积分数75%,料液比分别为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55,超声功率480 W,提取时间30 min。5 000 r/min离心5 min,取50.0 μL样品,用体积分数70%乙醇定容至10 mL,HPLC检测白藜芦醇含量。

1.2.2 白藜芦醇的分离提取

根据响应面得到的最佳条件提取白藜芦醇。称取100.0 g虎杖磨碎加入乙醇超声萃取,滤液通过减压蒸发浓缩得到白藜芦醇粗提物。分离提取方法根据文献[9]稍做修改。采用紫外分光光度计检测白藜芦醇,检测波长306 nm。

1.2.3 白藜芦醇提取率的测定

准确称取5.000 mg白藜芦醇标准品,用甲醇溶解并定容至100 mL,得50.0 μg/mL的标准品贮备液。用HPLC测定白藜芦醇含量,色谱柱C18(150 mm×3.9 mm,4 μm),流动相为体积比25∶75∶0.09的乙腈-水-乙酸,体积流量0.7 mL/min,检测波长306 nm,柱温30 ℃,进样量10.0 μL。计算白藜芦醇得率:

w=nρV/m×100%

式中:w为白藜芦醇得率,%;ρ为根据HPLC峰面积计算出的溶液质量浓度,mg/mL;n为溶液稀释倍数;V为供试品溶液体积,mL;m为虎杖取样量,mg。

1.2.4 白藜芦醇活性测定

DPPH自由基清除率:参照文献[10]、[11]稍做修改。在10 mL比色管中依次加入4.0 mL DPPH溶液和白藜芦醇提取液,再加入无水乙醇定容,混匀立即用1 cm比色皿在517 nm处测吸光度(A1),再在温室避光保存30 min后测吸光度(A2)。对照组为只加DPPH的乙醇溶液,吸光度记为A3。试验重复3次取平均值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%

羟自由基清除率:按照超氧自由基清除率检测试剂盒(Fenton比色法)说明书进行测定。测定536 nm处吸光度,对照管吸光度记为A′1,测定管吸光度记为A′2,空白管吸光度记为A′3,各管测定吸光度3次取平均值。

羟自由基清除率=[1-(A′1-A′2)/A′3]×100%

对成纤维细胞增殖的影响:成纤维细胞以DMEM为培养基(含青霉素50 μg/mL,链霉素50 μg/mL,10%胎牛血清),于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的成纤维细胞,胰蛋白酶消化后,制备细胞悬液,调整浓度为105个/mL,加入96孔培养板中,同时加入适量1 000.0 μmol/L用DMSO配制的白藜芦醇母液,补加培养液,使每孔终体积100 μL,每组白藜芦醇终浓度分别为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0 μmol/L,每个浓度6个复孔,同时设置未加白藜芦醇组为对照。培养24 h,加入20 μL MTT(5.0 mg/mL),4 h后加入100 μL DMSO,摇匀,在酶标仪测定OD490。

对UVB照射后成纤维细胞抗氧化指标的影响:试验分5组。对照组,不照射UVB,不加白藜芦醇;1、2、3、4组,分别为加入0、12.5、100.0、800.0 μmol/L白藜芦醇,照射UVB。取对数生长期的成纤维细胞,加入96孔培养板和培养皿中,各组加入相应的白藜芦醇,培养24 h后,给予UVB特殊光源辐射(强度30 mJ/cm2),照光结束后分组加入白藜芦醇,培养24 h后进行MTT试验,同时取培养皿中细胞制备细胞匀浆,参照试剂盒说明测定SOD、CAT、GSH、MDA水平。

1.2.5 数据处理

试验数据以平均值表示,制图采用Origin8.5绘制,响应面分析采用Design-Expert 8.0.6.1进行,使用SPSS25.0软件统计分析。

2 结果与讨论

2.1 白藜芦醇的HPLC检测分析

在选定的色谱条件下,标准品白藜芦醇的保留时间为(4.504±0.056) min。白藜芦醇标准品质量浓度与峰面积标准曲线回归方程为y=0.129 4x-0.007,R2=0.999 9,线性范围0～10.0 μg/mL,在此范围内线性关系良好。

2.2 白藜芦醇的分离提取与鉴定

2.2.1 单因素对白藜芦醇得率的影响

由图1可知,随着超声功率的增大,白藜芦醇得率逐渐增大,功率为480 W时白藜芦醇得率达到最大(图1(a))。提取时间在40 min时,白藜芦醇得率最高(图1(b))。乙醇体积分数为65%时,白藜芦醇得率最高,之后逐渐降低(图1(c))。料液比在1∶15时白藜芦醇得率最大(图1(d))。

(a) 超声功率

2.2.2 响应面试验分析

响应面设计见表1。以提取率(Y)为响应值,在单因素试验的基础上进行四因素三水平的工艺优化试验,试验设计因素水平见表2。

表1 响应面因素水平表

表2 响应面试验设计方案及结果

采用Design-Expert 8.06软件对结果进行回归分析拟合。回归方程:Y=4.75+0.22A+0.28B+0.11C+0.22D+0.18AB-0.27AC-0.037AD-0.35BC+0.080BD+0.11CD-0.61A2-0.52B2-0.35C2-0.68D2,试验结果的方差分析见表3。回归方程模型P<0.000 1,表明二次多项回归模型极度显著;失拟项不显著(P=0.189 6>0.05),说明模型与实际情况拟合程度较好。各因素对虎杖中白藜芦醇提取率的影响由大至小顺序为提取时间、料液比、提取功率、乙醇体积分数。

表3 回归模型的方差分析

由图2可以看出,A与C、B与C响应面相对较陡,等高线扁,说明交互作用较强。其他响应面较为平缓,等高线较圆,交互作用则相对较弱。采用软件对提取工艺进行参数优化,得到的最佳条件为超声功率495.53 W、提取时间33.0 min、乙醇体积分数63.67%、料液比1∶17.13,白藜芦醇提取率预测值为4.83 mg/g。为验证响应面预测的最佳工艺参数,实际参数设定为超声功率496 W、提取时间33 min、乙醇体积分数64%、料液比1∶17,按修正后条件进行3次平行试验得到的白藜芦醇得率为4.80 mg/g,接近预测值,说明优化后的工艺参数可靠。

(a) 提取时间和超声功率

2.2.3 白藜芦醇的分离与鉴定

选用NKA-9大孔吸附树脂初步分离白藜芦醇,HPLC检测分离结果,白藜芦醇质量分数由纯化前的15.6%提升至58.4%。白藜芦醇经ODS柱层析分离,HPLC鉴定结果为白藜芦醇。

2.3 白藜芦醇的抗氧化性

由图3(a)可知,随着白藜芦醇质量浓度的增加,DPPH自由基的清除率升高,当白藜芦醇质量浓度达到2.5 mg/mL时,清除率为94.92%,继续增大质量浓度,清除率基本不变。采用SPSS25.0软件计算,得到IC50为0.926 mg/mL,表明虎杖中的白藜芦醇具有较好的抗氧化能力。

(a) DPPH自由基

由图3(b)可知,羟自由基的清除率随着浓度的升高而增大,当白藜芦醇质量浓度达到0.5 mg/mL时,清除率达到94.65%。采用SPSS25.0计算,得到IC50为0.165 mg/mL,表明虎杖中白藜芦醇对羟自由基的清除效果显著。

2.4 白藜芦醇对紫外照射成纤维细胞的保护作用

如图4所示,与对照组相比,1组SOD酶活力下降最大,下降了72.6%,2组、3组、4组SOD酶活力分别下降了65.8%、42.3%和12.4%(P<0.01)。紫外照射导致皮肤成纤维细胞中MDA含量增加,但经白藜芦醇处理后,皮肤成纤维细胞中的MDA含量明显下降,白藜芦醇添加量越大,MDA含量下降越明显。白藜芦醇处理皮肤成纤维细胞后,SOD、CAT酶活力和GSH含量均明显增加。SOD催化氧自由基转变成低活性氧,减少对皮肤成纤维细胞的伤害;CAT自由基清除能力提高。因此,白藜芦醇可以有效减缓紫外引起的皮肤成纤维细胞损伤。

*表示P<0.01,与对照组相比,具有统计学意义;#表示P<0.05,与对照组相比,具有统计学意义(n=6)

3 结 论

以虎杖为原料,白藜芦醇提取工艺的优化条件:超声功率496 W,提取时间33 min,乙醇体积分数64%,料液比1∶17。在最优条件下,白藜芦醇的提取率达到4.80 mg/g,与模型预测值(4.83 mg/g)基本相符合。通过大孔吸附树脂和碳十八键合硅胶树脂分离得到提取物,经HPLC和红外线鉴定为白藜芦醇,且白藜芦醇纯度高,达到99.90%。抗氧化性试验结果表明,虎杖粗提物中的白藜芦醇对DPPH自由基和羟自由基清除能力良好,可以作为抗氧化剂的新型来源。紫外照射成纤维细胞的保护作用试验结果表明,白藜芦醇可以通过提高皮肤成纤维细胞中的SOD、CAT酶活性与GSH含量以及降低MDA含量来缓解紫外线造成的皮肤伤害。