鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

于 柳

（大连市金普新区动物疫病预防控制中心，辽宁 大连 116100）

鸭病毒性肝炎病毒是一种高致病性传染性疾病，其病程短、发病急、传播速度快、致死率高，临床症状为抽搐、痉挛、角弓反张等症状。此病毒主要危害1月龄内的雏鸭，周龄越小死亡率越高，严重制约着养鸭业的发展。本文对鸭病毒性肝炎病毒分离与鉴定方法进行综述，为此病的防控提供参考。

1 病毒分离与鉴定

鸭病毒性肝炎病毒常用鉴定方法是分离培养病毒。动物培养、细胞培养和鸭胚尿囊腔接种是3种病毒分离方法。在细胞培养中，国外研究者报道此病毒可在鸭胚（鸡胚）肾细胞、鸭胚（鸡胚）成纤维细胞和鸭胚肝细胞中生长增殖。鉴于不同毒株毒力强弱与对不同细胞适应性存在的差异，该病毒在细胞上会产生轻微病变或不发生细胞病变。通常情况下，病毒初代分离使用鸭胚，连续传若干代之后易增殖。死亡鸭胚的主要特征为皮肤水肿、出血、侏儒症、肝脏水肿呈绿色。在传代中，病死率升高，死亡特征显著。采集死胚尿囊液，采用中和试验和电镜技术等方法进行鉴定。

2 血清学方法

2.1 中和试验

检测鸭病毒性肝炎肝炎病毒最可靠、最经典的方法时中和试验。此方法可在鸡胚、鸭胚、雏鸭进行固定血清—稀释病毒。研究者发现，在56℃条件下，被检血清灭活半小时，将病毒与血清的混合液在接8日龄鸡胚前37℃水浴40分钟，检出率可明显提高。

2.2 间接血凝与血凝抑制试验

间接血凝试验通过不断改进可用于检测血清中存在的各种病原抗体，与酶联免疫吸附测定相比，此方法操作简便、迅速、设备要求不高。我国研究者将间接血凝抑制试验同中和试验进行比较，检测阳性结果符合率达85%。

2.3 乳胶凝集试验

研究人员使用提纯浓缩的抗鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶建立了快速检测抗原的反向乳胶凝集试验法。结果显示，抗体致敏乳胶未出现自凝情况、特异性强、可重复，安全可靠。并且，通过竞争凝集的原理，采用提纯浓缩的抗Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒抗体致敏乳胶结合待测血清抗体，建立了乳胶凝集试验检测法，此方法对抗原纯度要求不严格，避免鸭病毒性肝炎病毒难以纯化的情况。经试验检测，0.02毫克/毫升为结合最小抗原量。此方法与其他病原不发生任何反应，阻断效果显著，检测Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒抗体可达1∶800，比琼脂扩散试验高50倍。该检测法对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒检测敏感性强、特异性高、可重复、质量稳定可靠，适合应用于临床流行病调查。

2.4 琼脂扩散试验

鸭病毒性肝炎病毒为无囊膜病毒。研究者选用不同的鸭肝炎病料，采用反透析法和氯仿去脂法对病毒进行提纯浓缩，应用琼脂扩散试验对鸭病毒性肝炎病毒进行检测，结果表明用抗体血清检测病毒抗原，检出率可达80%。此方法操作简便，但灵敏度与特异性还有待于提高。

3 分子生物学方法

3.1 RT-PCR

PCR的优点为灵敏度、特异性高，迅速，易于操作。随着研究者对鸭病毒性肝炎病毒基因序列的深入研究，PCR已广泛应用于本病毒病原的检测。研究者参照鸭病毒性肝炎病毒保守区设计物，建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的RT-PCR方法。为高效防治鸭病毒性肝炎病毒提供了参考，并降低养殖户的经济损失。

3.2 套式RT-PCR

我国研究人员陆续建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的套式RTPCR检测法。此检测法多用于该病的早期诊断、病理检测等。研究者采用双重RT-PCR检测法对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和N型鸭病毒性肝炎病毒进行鉴别诊断。

3.3 荧光定量RT-PCR

研究者基于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D区域序列设计TaqMan探针和引物，建立了荧光定量RT-PCR检测法。此方法研究了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒弱毒在鸡胚内部的分布情况和强毒在鸭胚内部的分布情况，对人工感染Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的动态分布情况进行定量检测。

4 结束语

鸭病毒性肝炎病毒的快速传播与高致病性，是严重危害雏鸭的传染病之一。近些年，分子生物学技术飞速发展，PCR和荧光定量PCR检测法广泛应用于病毒病原的检测。通过进一步的分子生物学研究，将建立一套快速、高效、完整的鸭病毒性肝炎病毒检测法，以促进鸭养殖业的持续发展。