血清外泌体LncRNA作为强直性脊柱炎早期诊断分子标记物的筛选研究

华凤伟, 于 阔, 王家琦

(北大荒集团总医院/黑龙江省第二肿瘤医院骨二科, 黑龙江 哈尔滨 150000)

强直性脊柱炎(AS)是由自身免疫性失衡引起的长期炎症性关节炎,它通常伴有炎症性背痛、三种外周关节表现(关节炎、附着点炎和指趾炎)、三种外表表现(葡萄膜炎、银屑病和克罗恩病)、两种遗传特征(AS 和 HLA-B27 家族史)和两种炎症特征(对非甾体抗炎药反应良好和 CRP 水平升高)。当结构损伤的触发点被激活时(磁共振成像显示炎症后脂肪沉积或骨髓水肿),即使活动得到控制,结构损坏的过程也不会停止[1]。停止这一进程的机制仍不清楚。外泌体是30～100nm细胞来源的囊泡,含有由内吞作用形成的多种分子,可在几种体液(如血液、尿液、唾液、胸腔积液和羊水)中找到[2]。最近的研究表明,外泌体在血液中是稳定的,可以递送大量蛋白质、脂质和核酸,包括长非编码RNA(LncRNA)[3]。体液外泌体被认为是有希望的癌症生物标志物,但血浆外泌体在CRC诊断中的潜在作用尚未报道。近年来,一些研究表明,长链非编码RNA(LncRNA)在不同细胞类型或组织中普遍失调,全血细胞、外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、髋关节细胞和成骨分化的骨髓间充质干细胞中的LncRNA参与关键促炎细胞因子的调节,例如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-23/IL-17[4]。需要更多的机制研究来确定更重要的LncRNA及其下游途径,这些途径对AS的发病机制至关重要。最近的研究表明,细胞外囊泡连接的LncRNA可以在受体细胞中促进规定的反调节模式,并参与设想靶细胞中引发的表观遗传调控、细胞重编程和基因组不稳定性的新机制,导致衰老相关肿瘤起始细胞的产生,这些细胞对化疗具有抗性[5]。然而,外泌体LncRNA在CRC早期诊断中的作用尚不清楚。在这项研究中,通过RNA测序比较了CRC患者和对照个体之间血浆外泌体样本中的许多LncRNA,然后扩大了样本容量以测试其可行性。探究血清外泌体LncRNA作为强直性脊柱炎早期诊断分子标记物的,为进一步研究提供理论依据

1 材料与方法

1.1对象:本研究收集了2021年1月至2022年12月医院的早期AS患者和健康对照组的全血样本,本研究中AS的患者为影像学表现为早期损伤的患者,参照强直性脊柱炎X线分期标准,早期表现为:骶髂关节间隙模糊,并稍致密,关节间隙增宽。在来自每个受试者的乙二胺四乙酸管中收集新鲜血浆样品(3mL)。将这些样品在3000℃下以10×g离心4min,后储存在-80℃。所有患者和健康对照组都被告知了这项研究,并在签署同意书后被纳入研究。本研究经医院伦理委员会批准(No.2021KA011)。

1.2血浆外泌体分离:差速离心被认为是金标准,也是分离外泌体最常用的方法。首先,将样品在室温下以3000×g和10000×g离心两次20min,以除去血浆中的细胞和其他碎片,后将上清液在100℃下以30000×g离心4min以除去大于外泌体的微泡收获,并在10℃下再次以70000×g离心4min,轻轻倾析上清液,并将外泌体沉积物重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

1.3透射电子显微镜:用PBS将外泌体悬浮液稀释至0.5mg/mL,点样到放置在滤纸上的发光放电铜网格上,并通过暴露于红外光干燥10min。接下来,将外泌体样品用一滴磷钨酸(1%水溶液)染色5min,并通过暴露于红外光干燥20min。最后,在透射电子显微镜(HT7700,日立,东京,日本)下以100keV观察外泌体。

1.4蛋白分子印迹:使用裂解缓冲液从外泌体样品中提取总蛋白。将每个样品(40μg)上样到12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上,后转移到聚偏氟乙烯膜上(德国曼海姆罗氏)。将这些膜在室温下浸入2%牛血清白蛋白中1h,并与以下一抗一起孵育:抗Tsg101(1∶1000,圣克鲁斯生物技术),抗CD63(1∶2000,Abcam)和抗阿利克斯(1∶1000,圣克鲁斯生物技术),在用PBS洗涤后与适当的二抗孵育。最后,通过用电化学发光试剂孵育来观察蛋白质条带。

1.5纳米颗粒跟踪分析:使用Nanosight NS 300系统(NanoSight Technology,英国马尔文)测量外泌体的大小,将外泌体以5μg/mL的浓度重悬于PBS中,并进一步稀释500～1000倍,在室温下手动将样品注入样品室。每个样品都配置了一个488nm激光器和一个13的高灵敏度sCMOS相机设置,采集时间为30s,检测阈值设置为7。每个视频至少分析了200个已完成的曲目。最后,利用纳米颗粒跟踪分析软件对结果进行分析。

1.6ceRNA芯片的安捷伦方法:根据制造商的说明,使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离来自外泌体的总RNA,并使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen GmBH)纯化,使用每组的RNA样品为人ceRNA阵列V1.0(上海生物技术公司,中国上海),后将标记的cRNA靶标与载玻片杂交。杂交后,在安捷伦微阵列芯片扫描仪(安捷伦科技公司)上扫描载玻片,使用特征提取软件10.7(安捷伦科技公司)提取数据。原始数据通过R程序中limma包的分位数算法进行归一化。微阵列实验在上海生物技术公司按照安捷伦科技公司的方案进行。计算AS与正常受试者(NC)之间的比率。选择倍数变化至少为2的基因进行进一步分析。基于基因本体数据库(http://www.geneontology.org/)将环状RNA的亲本基因分类为功能类别,并使用上海生物技术公司的在线富集分析工具对功能通路(京都基因和基因组百科全书)进行分析。

1.7qRT-PCR:根据制造商的说明,使用TRIzol LS试剂(Invitrogen,卡尔斯巴德)从血浆中提取外泌体的总RNA,并使用NanoDrop ND-2000分光光度计(赛默飞世尔科技,威尔明顿,DE)进行定量。cDNA是使用PrimeScript RT试剂盒(Takara Bio Inc)根据制造商的方案使用随机引物通过逆转录合成的。使用SYBR预混料Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus;高良生物公司)在CFX96实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad,Hercules,CA)上。不同的引物由Sangon Biotech(中国上海)合成。使用2-ΔCt方法。所有结果表示为三个独立实验的平均值±标准差。

1.8LncRNA相关靶基因的预测:选择差异表达的LncRNA进行靶标预测,在LncRNA上游或下游10kbp窗口内转录的基因被认为是顺式作用靶基因。使用RNAplex软件预测交易靶基因。

1.9统计学分析:所有统计分析均使用适用于Windows的SPSS22.0软件和GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,La Jolla,CA)进行。使用配对数据的t检

验评估AS患者和配对样品之间每种LncRNA水平的差异。P<0.05值被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1血浆外泌体的表征:为了确定通过超速离心从血浆中分离的颗粒是否是外泌体,进行了透射电子显微镜和蛋白质印迹分析,分离的颗粒表现出外泌体的真实特征,即尺寸约为100nm的球形形态,并且发现富含外泌体标记蛋白Tsg101,CD63和Alix,如蛋白质印迹所示,见图1。

图1 血浆外泌体的表征

2.2强直性脊柱炎患者外周血浆外泌体LncRNA谱:为了验证AS患者和健康受试者之间LncRNA的表达是否存在差异,从10例AS患者和10例健康个体中提取血浆外泌体RNA,并使用上述ceRNA阵列进行分析。结果表明,两组之间LncRNA的表达存在显著差异,1705个LncRNA的表达差异显著,626个LncRNA上调,1079个下调,见图2。

图2 强直性脊柱炎患者外周血浆外泌体LncRNA谱

2.3强直性脊柱炎患者中LncRNA的血浆表达水平:为了选择活的生物标志物,选择了以下六种表达增幅最大的LncRNA进行后续分析:LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV6_108266、LNCV6_84003和LNCV6_98602,在AS患者血浆中的水平显着高于阴性对照个体血浆中的水平(P<0.05)。所有六种LncRNA的P相同(P<0.05),见图3。

图3 强直性脊柱炎患者中LncRNA的血浆表达水平

2.4强直性脊柱炎患者中高表达LncRNA的验证:为了分析AS患者和健康受试者之间六种选定LncRNA的表达差异,从另一个队列中提取RNA,其中包括50例AS患者和50例健康受试者。通过qRT-PCR检查所选LncRNA的表达水平。数据证实这些LncRNA在AS患者中的表达水平明显高于健康个体。LNCV6_116109的表达最显着地上调(P<0.001),而LNCV6_84003的上调最不显着(P<0.05)。结果表明,这六种LncRNA可以被认为是AS的诊断生物标志物(图4A-F)。

图4 强直性脊柱炎患者中高表达LncRNA的验证

2.5外泌体LncRNA在结直肠癌中的潜在诊断价值:构建受试者工作特征(ROC)曲线,以估计六种血浆外泌体LncRNA的敏感性和特异性。等离子体样品的曲线下面积(AUC)值分别为0.8052(LNCV6_116109)、0.7088(LNCV6_98390)、0.7460(LNCV6_38772)、0.7292(LNCV6_108266)、0.7356(LNCV6_84003)和0.6800(LNCV6_98602),见图5。

图5 外泌体LncRNA在结直肠癌中的潜在诊断价值LncRNA的ROC曲线分析

2.6LncRNA的预测下游靶标:为了进一步研究差异表达的LncRNA在AS中的作用,使用生物信息学方法预测了它们的顺式靶基因。LNCV6_84003、LNCV6_98602、LNCV6_108266、LNCV6_116109、LNCV6_98390和LNCV6_38772的靶基因,见图6。

图6 LncRNA的预测下游靶标

3 讨 论

目前,AS是一种无法治愈且使人衰弱的自身免疫性疾病,控制疾病活动不能完全抑制结构损伤[6]。因此,早期诊断已成为AS防治的迫切需要。

在过去的十年中,LncRNA功能的发现和表征揭示了多种调节作用[7]。最近的一项研究表明,外周血LncRNA NONHSAT118801.2 和 NONHSAT183847.1 水平在 AS 患者中降低,并且与CRP 和 ESR水平呈负相关,这表明 LncRNA 具有潜在的保护作用[8]。RNA测序数据显示,LncRNA有助于AS的疾病进展[8]。研究表明,在癌症患者的血浆或血清中检测到循环RNA,使其成为肿瘤诊断的新型生物标志物[9]。外泌体因其特定特征而受到越来越多的关注。研究发现,外泌体由各种细胞类型分泌,在正常和病理条件下参与许多生物学功能,还可以作为生物活性分子的载体以促进肿瘤发生[10]。在血浆中,包装成外泌体的LncRNA可以防止降解,从而提高其在循环中的稳定性,为了获得稳定的RNA浓度,未离心的凝血应储存在4℃并在6h内处理,长期储存可能导致其退化[11]。研究显示AS患者和1个配对正常样本的转移相关肺腺癌转录本(MALAT)表达,证实其在AS组织中表达上调,MALAT可能作为阴性预后标志物[12]。研究报道了15种LncRNA,通过比较脊柱炎组织和邻近组织获得的被证明与AS进展中的多种生物过程有关,但LncRNA在这些组织中的表达水平不一定与血浆中的表达水平相同。只有少数研究关注血浆LncRNA在AS诊断中的作用,更少研究关注血浆外泌体。本研究是第一个将外泌体LncRNA与AS诊断联系起来的研究。

本研究发现与健康个体相比,AS患者外泌体LncRNA的表达水平显着上调。其中,6种高表达LncRNA(LNCV6_84003、LNCV6_98602、LNCV6_108266、LNCV6_116109、LNCV6_98390和LNCV6_38772)进行了进一步验证。结果表明,与正常受试者相比,AS患者在外泌体中的血浆表达水平上调。ROC曲线分析证实了这些LncRNA的诊断价值,表明它们有可能用作AS的新型生物标志物。此外,使用生物信息学方法预测了它们的顺式靶基因,尽管本研究取得了积极的结果,但需要进一步的研究来阐明这些LncRNA在AS中的特定作用,该研究有以下局限性。首先,本研究为单中心、小样本研究,其结论需要在多中心、大样本研究中得到证实,此外,还需要进一步的研究来阐明这些LncRNA在AS中的特定作用,应研究LncRNA表达水平上调的AS发生阶段。

综上所述,本研究显示的研究表明通过比较不同血浆外泌体样品中LncRNA的表达水平,鉴定出一组6种具有高灵敏度和特异性的LncRNA,可作为AS无创筛查的生物标志物。