化学分析方法校准曲线有关问题的探讨

刘景泰,刘秀洋,曲 翊

辽宁省大连生态环境监测中心,辽宁 大连 116023

校准是化学定量分析方法的先决条件,科学准确的校准是保证检测结果准确的核心。目前国内分析方法标准绝大多数采用线性最小二乘法回归校准曲线,也有极少情况下采用二阶或三阶校准曲线。绝大多数线性校准方法只对回归系数提出要求,对校准曲线的检验方式未给出明确规定。对于校准曲线,一是要确定曲线的校准范围,曲线最低点要与定量下限相衔接;二是曲线各点经拟合曲线重新计算后,拟合值与实际值偏差不能超过一定范围。笔者通过研究国际、国内校准相关方法,提出校准曲线使用的具体原则,以期促进国家和行业标准中关于校准内容的方法制定和修订,完善分析方法标准中关于校准曲线的线性范围、校准方式和合格检验等相关内容。

1 校准曲线范围的确定标准

分析方法的定量工作范围应是校准曲线的最低点和最高点之间的浓度范围。USEPA环境测量论坛规定,校准曲线应包含所测定样品的浓度范围[1]。《化学分析和水状态监测的技术规范》(欧盟委员会指令2009/90/EC)规定,成员国应确保应用的所有分析方法满足最低性能标准,即在环境质量标准浓度水平下的测量不确定度(k=2)小于等于环境质量标准的50%,测定下限等于或低于相关环境质量标准的30%,测定下限可从校准曲线上的最低校准点获得[2]。CAC/GL 90—2017要求分析方法必须足够灵敏,以使每种分析物的测定下限等于或低于当前法典最大残留限量(CXL)[3]。

《水和废水的检验方法20版》(美国公共卫生协会)规定,校准曲线最低浓度点选择在测定下限处[4]。ISO 6107-2:2006规定,测定下限可使用适当的标准品或样品进行计算,并且可以从校准曲线上的最低校准点获得(不包括空白样品)[5]。ISO 8466-1:2021规定,校准范围的最低点浓度应大于或等于测定下限[6]。ISO/TS 13530:2009中规定,方法应用范围的最低和最高浓度是通过精度和偏差验证得到的,不能随意扩大方法的浓度应用范围[7]。

《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)规定,测定下限应尽可能满足生态环境质量标准、生态环境风险管控标准、污染物排放标准、国际履约等生态环境管理工作中对目标物的最低限值浓度(含量)水平的测定要求[8]。

实际工作中,对于曲线的最高点,在尽量扩大工作浓度范围的情况下,要保证校准曲线是线性,同时,最高点分析后不会对分析系统造成污染物残留,影响下一个样品的检测结果准确性。同一个污染物,环境质量标准和污染物排放标准限值差别较大(有时达到3个数量级以上),所以在制定分析方法标准时要根据不同的要求采取不同的前处理方法。对于适用环境质量标准的分析方法,可以采取样品富集浓缩等预处理步骤,降低方法检出限和测定下限;对于适用于污染物排放标准的分析方法,则可以采用直接进样等不对样品进行富集浓缩的方法,提高方法的检出限和测定下限。

综上,校准曲线范围应是最低点和最高点之间的浓度范围,最低点浓度应在测定下限附近,且大于或等于测定下限,最高点应尽量扩大工作浓度范围,且分析后不会对分析系统造成污染物残留。

2 校准曲线的校准方式

ISO/TS 13530:2009中规定了3种校准方式:一是纯标准溶液校准,适用于样品基体对校准曲线的斜率和截距没有显著影响,同时也不需进行样品制备的分析过程;二是使用带有样品基体的标准溶液校准,标准溶液用不含目标物的样品基体或人造样品基体配制,也同样不需进行样品制备过程;三是全程序校准,也可以称为工作曲线校准,校准包含所有的样品制备步骤,标准溶液用有代表性的基体材料制备。

ISO 8466-1:2021规定了5种线性校准方法,即外标法、内标法、全程序外标法、全程序内标法和标准添加法,5种线性校准方法的应用范围见表1。

表1 5种线性校准方法应用范围Table 1 Application range of five linear calibration methods

综上,校准曲线的校准方式应根据方法原理、仪器的特点和样品基质情况进行选择,建议参照ISO/TS 13530:2009和ISO 8466-1:2021中规定选择适合的校准方法。

3 校准浓度级别要求

ISO 8466-1:2021规定,对于多点校准,校准点浓度应分布在整个校准范围内,至少应有5个校准点;对于1点和2点校准,每个浓度级别至少重复测定3个样品。ISO 8466-2:2001推荐10个浓度级别校准[9]。USEPA 600系列方法规定至少要有3个校准点,最低点接近方法检出限,最高点在线性范围的上限附近,第3点浓度是最低点和最高点的中间浓度。大部分方法要求有5个以上校准点。USEPA SW-846的色谱方法中,线性校准需要做至少5点校准曲线,非线性二阶校准需要做6点校准曲线,非线性三阶校准需要做7点校准曲线,无论采用几点校准曲线,各校准点中都不含零点[10]。

《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》(GB/T 32465—2015)中规定,应在校准曲线浓度范围均匀设置6个或6个以上的校准标准点(包括空白或1个低浓度标准点),不同浓度点的校准标准溶液要单独配制,不能通过稀释同一母液获得[11]。《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)中规定校准曲线至少具有6个校准点(包括空白),浓度范围尽可能覆盖1个或多个数量级,每个校准点至少以随机顺序重复测量2次,最好是3次或更多,校准用的标准点应尽可能均匀地分布在关注的浓度范围内并能覆盖该范围。在理想的情况下,不同浓度的校准溶液应独立配制,低浓度的校准点不宜通过稀释校准曲线中高浓度的校准点进行配制[12]。《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)要求校准曲线至少有6个校准点(包括零浓度)。

综上,线性校准应按照《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)要求进行6点校准(包括零浓度),非线性二阶校准曲线按照USEPA SW-846要求做7点校准(包括零浓度),非线性三阶校准曲线按照USEPA SW-846要求做8点校准(包括零浓度),校准点应尽可能均匀地分布在线性范围内。

4 校准曲线及线性检验方式

校准曲线分为线性和非线性2种。线性回归曲线包括线性最小二乘法回归曲线、平均校准系数或响应系数曲线、加权最小二乘回归曲线等。非线性校准曲线包括二阶校准曲线、三阶校准曲线等。

USEPA SW-846 8000D标准中色谱方法允许使用3种不同的校准曲线(平均校准系数或响应系数、线性回归和非线性回归校准曲线)。校准曲线的选择可以从最简单的方法开始,即先选用平均校准因子或响应因子曲线,达不到标准后,选择线性曲线,最后选择非线性曲线,直到满足校准验收标准为止。也可以根据以往的经验、检测器的物理特性或仪器制造商的建议,选择合适的校准曲线。

USEPA SW-846 6010C(电感耦合等离子体原子发射光谱法)和6020A(电感耦合等离子体质谱法)中就指出,许多碱金属和碱土金属由于电离和自吸收效应而具有非线性响应曲线。

《化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南 色谱分析》(GB/T 35655—2017)规定,实验室应按照《基于标准样品的线性校准标准》(GB/T 22554—2010)提供的方法实施校准曲线线性性能评价,通过校准曲线线性性能评价,确认校准曲线的剩余标准偏差是满足常数剩余标准偏差的假设,还是满足比例剩余标准偏差的假设,并得出合理的拟合校准曲线[13]。

《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)规定,定量方法线性回归方程的相关系数不低于0.999;若使用平均相对响应因子进行计算,一般要求相对响应因子的相对标准偏差不超过20%。

4.1 线性回归校准曲线及检验

4.1.1 采用曼德尔拟合优度检验

在ISO 8466-1:2021中,方差齐性一直是线性检验的关键要求。因此,在许多情况下,工作范围被限制在一个数量级以内。曼德尔拟合优度检验是用校准曲线数据分别绘制线性校准曲线和二次校准曲线,检验线性校准曲线与二次校准曲线相比较是否具有足够的拟合优度,是否适合于一个数量级以上的工作范围和几乎等距的校准浓度分布。

通过计算一次校准曲线(y=a+bx)和二次校准曲线(y=a+bx+cx2)的残差标准差,计算一次校准曲线和二次校准曲线平方差总偏差。一次校准曲线残差标准差(Sy1)参考公式(1),二次校准曲线残差标准差(Sy2)参考公式(2),计算平方差总偏差(DS2)参考公式(3)。

(1)

(2)

DS2=(N-2)·Sy1-(N-3)·Sy2

(3)

通过计算用于F检验的Fcalc值,进行校准曲线的线性判断。

(4)

查询ISO 8466-2:2001中F值表,其中显著性水平α=0.01、f1=1、f2=N-3。如果Fcalc

当曼德尔的拟合优度检验产生“非线性”结果,则可以剔除1个校准点,并再次进行残差F检验。重复这个过程,直到根据曼德尔拟合优度检验后,校准曲线呈线性,确定一个更窄的线性范围。

4.1.2 点对点的斜率检验

对于浓度在几个数量级的对数尺度上的校准,曼德尔的拟合优度检验会导致“非线性”结果,根据ISO 8466-1:2021的规定,可通过计算点对点的斜率来估计线性范围。

计算每相邻2个校准点的斜率bi,然后求出bi的中位值bm。当bi的数量为偶数时,bm为中间2个bi值的算术均值。计算Δbi-m=bi-bm。如果结果在一定的工作浓度范围内,Δbi-m在零线附近呈正态分布,则认为在这个工作浓度范围内校准曲线呈线性。为方便判断,在零线的上下设定Δbi-m限制线,一般上下限值设定为中位值的10%,Δbi-m在上下限之间的浓度范围,即校准曲线的线性范围。上下限值可以根据分析的精度要求进行调整。

4.1.3 1/x加权回归校准曲线及检验

USEPA SW-846 8000D指出,未加权的回归曲线校准曲线高浓度点的拟合效果比低浓度点好,如果关注的浓度是在较低的浓度水平,那么非加权回归曲线往往会给出不太准确的结果。如果加权,加权系数一般为1/x或1/x2。

ISO 8466-1:2021对于校准范围较宽的非等距校准,在低浓度范围校准点聚集,采用1/x加权回归与简单的线性回归相比,因为加权回归使评定标准不确定度的方法偏差组成部分减少,所以能带来更小的测量不确定度。

《基于标准样品的线性校准标准》(GB/T 22554—2010)采用的是ISO 11096:1996标准,其特点是采用比例剩余标准偏差校准曲线,曲线中用倒数关系把大的残差变小,把小的残差变大,进行加权修正。这种加权修正法最直观的作用,就是减小校准曲线2段高低含量测量值的方差。这种方法在常量分析中的好处不明显,但是在微量、半微量分析(如色谱分析)中就比较有优势。但《基于标准样品的线性校准标准》(GB/T 22554—2010)要求至少分析3个浓度级别样品,每个样品至少测量2次,数据量、计算量大,操作复杂,某些步骤需要人工手动判定,一般实验人员难以理解和操作,难以推广。

4.1.4 使用平均校准因子或响应因子进行线性检验

USEPA SW-846 8000D标准中外标法校准因子(CF)为目标物的响应与目标物质量(浓度)的比值,内标法响应因子(RF)为目标物响应值乘以内标物浓度与内标物响应值乘以目标物浓度的比值。计算标准差(SD)和标准偏差(RSD),如果RSD≤20%,则认为曲线呈线性。这个RSD方法等价于一条强制通过原点的1/x2加权的最小二乘法线性回归曲线。

CAC/GL 90—2017认为决定系数(r2)可能会产生误导,因为它对浓度较高的标准品具有更大的意义。在这种情况下,应考虑使用适当的加权因子(如1/x或1/x2),以最大程度地降低低浓度范围的潜在影响。

《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)中规定,若使用平均相对响应因子进行计算,一般要求相对响应因子的相对标准偏差不超过20%。

4.1.5 使用相关系数、决定系数进行线性检验

相关系数(r)是反映变量之间相关关系密切程度的统计指标,是按积差方法计算,同样以两变量与各自平均值的离差为基础,通过2个离差相乘来反映两变量之间的相关程度,着重研究线性的单相关系数。具体计算见公式(5)。

(5)

决定系数(r2)是评价校准曲线拟合优度的统计量,最大值为1。拟合优度是指校准曲线对测定值的拟合程度。这里的拟合可以是线性的,也可以是非线性的,即使线性的也不一定要用最小二乘法来拟合。其计算见公式(6)。

(6)

USEPA SW-846 8000D规定,在非加权线性最小二乘法的情况下,相关系数≥0.995或决定系数≥0.99。其中,SW-846 7000B(火焰原子吸收分光光度法)和7010(石墨炉原子吸收分光光度法)中要求相关系数≥0.995,6010C(电感耦合等离子体原子发射光谱法)和6020A(电感耦合等离子体质谱法)中要求相关系数≥0.998,6200(现场便携式X射线荧光光谱法测定土壤和沉积物中的元素浓度)中要求相关系数≥0.98,《水和废水的检验方法20版》(美国公共卫生协会)要求相关系数≥0.995。

《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》(GB/T 32465—2015)中规定相关系数应不小于0.997,《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)规定筛选方法线性回归方程的相关系数不低于0.98,准确定量方法线性回归方程的相关系数不低于0.99。《环境监测分析方法标准制订技术导则》(HJ 168—2020)要求定量方法线性回归方程的相关系数不低于0.999。

线性回归校准曲线包括线性最小二乘法回归曲线、平均校准系数或响应系数曲线等,可以根据方法原理和仪器设备状况进行选择。线性回归校准曲线的检验方式主要包括曼德尔拟合优度检验、点对点的斜率检验、加权回归校准曲线检验、平均相对响应因子和相关系数检验5种方式。生态环境监测分析方法常用的线性检验方式主要有平均相对响应因子和相关系数检验2种方法,其他检验方法应用较少。

4.2 非线性二阶校准曲线及检验

ISO 8466-2:2001规定了非线性二阶校准曲线方差齐性检验方法。确定线性范围后,测定至少5个(推荐10个)浓度的标准溶液,标准溶液浓度应在线性范围内均匀分布。重复测定各n次,计算最低点和最高点方差齐性值s1和s10,然后进行单侧F检验,判断曲线最高点和最低点的显著性差别。

USEPA SW-846 8000D对非线性校准曲线的检验采用决定系数,要求非线性校准曲线的决定系数≥0.99。

非线性二阶校准曲线的检验方式主要为方差齐性检验和决定系数检验,生态环境领域监测人员比较熟悉的是决定系数检验方式。

4.3 校准曲线的验收标准

4.3.1 线性校准曲线的验收标准

ISO 8466-1:2021、ISO 22104:2021、EPA SW-846 8000D和GB/T 32465—2015等国际和国内标准对线性校准曲线的验收标准作出规定,生态环境监测分析方法《土壤和沉积物 挥发性有机物的测定 吹扫捕集/气相色谱-质谱法》(HJ 605—2011)和《土壤和沉积物 挥发性有机物的测定 顶空/气相色谱-质谱法》(HJ 642—2013)中线性校准曲线的验收标准主要为将曲线最低点的响应值代入曲线计算,目标物的计算结果应为实际值的70%～130%。

4.3.2 非线性二阶校准曲线的验收标准

按照ISO 8466-2:2001建立最终工作范围后,确定二阶校准曲线为y=a+bx+cx2。测定10个浓度的标准溶液,10个浓度在工作范围内等距分布。在工作范围内,校准曲线不得存在有比第1个点小,比第10个点大的值。如果灵敏度(校准曲线的斜率,e)在任意点(x*)处变为零,则可以得出该校准曲线没有明确意义,不可以使用该二阶校准曲线进行校准和数据计算。

国内外标准中校准曲线的验收标准如表2[3,6,9-11,14-16]所示。

表2 校准曲线的验收标准Table 2 Acceptance criteria for linear functions

线性校准曲线的验收标准不能仅考虑相关系数、相对响应因子均值和曲线中间点,还需要把曲线各点代入校准曲线重新计算,反算后与实际值误差不能超过一定数值[17-18]。对于非线性二阶校准曲线的验收,应进行最大值与最小值检验。

5 校准曲线使用总结和建议

根据国内外标准的相关规定统计,校准曲线的第1个浓度点应在测定下限附近,原则上测定下限应小于相关标准最严限值的1/4,从技术上如果难以达到,测定下限至少要低于相关标准最严限值,测定上限应尽可能扩大。分析浓度最高点样品后应进行试剂空白检验,试剂空白的值原则上应小于方法检出限。

校准曲线的校准方式应根据方法原理、仪器的特点和样品基质情况进行选择。可以选择外标法、内标法、全程序外标法、全程序内标法和标准添加法。

对于线性校准曲线的线性检验,除了相关系数,还要根据不同情况,对校准曲线进行曼德尔拟合优度检验、点对点的斜率检验、平均校准因子(CF)或响应因子(RF)检验等;对于非线性二阶校准曲线,可以采用决定系数或方差齐性进行检验。

校准曲线的验收标准,除了考虑相关系数外,简单起见,推荐采用USEPA SW-846 8000D方法,即用校准曲线重新计算校准点,校准曲线各点经校准曲线反算后,拟合值与实际值误差不能超过30%;特殊情况下,最低浓度校准点计算结果拟合值与实际值的相对误差可以允许在50%以内。对于非线性二阶校准曲线,应进行最大值与最小值检验,作为校准曲线能否使用的标准。