高效液相色谱法测定化妆品中类视黄醇含量

羊洁芳，楼美娟，卢 力，姜士磊

（义乌市检验检疫科学技术研究院，浙江 义乌 322000）

随着年龄的增长，人的皮肤会长出岁月的沟壑，最直接的原因是皮肤组织结构中角质层细胞的减少.类视黄醇物质可有效改善这一趋势.视黄醇被人体表皮细胞吸收后由视黄醇脱氢酶催化转变为视黄醛，视黄醛进一步被快速氧化成视黄酸，最终视黄酸与相关受体结合，促进角质层细胞形成和代谢[1-2].虽然视黄酸可直接发挥作用，但其作为药用成分不得添加于化妆品中[3]，故类视黄醇成为化妆品公司追捧的对象[4-5].大量研究表明，类视黄醇在淡化细纹、细致毛孔方面作用显著，更有早晨涂抹维生素C，晚上涂抹维生素A（即视黄醇），可以科学抗老的说法，深受年轻人喜爱[6].类视黄醇是多烯烃类物质，易受日光、温度、酸碱、重金属等影响，分解生成副产物，过量添加、保存不当等会造成皮肤干燥脱皮、红肿过敏、发炎等不良反应[7-8].通过Carlotti 等[7]的研究，发现在类视黄醇中加入少量抗氧化剂二丁基羟基甲苯，可起到稳定作用.因此，建立科学的测定方法检测化妆品中类视黄醇的含量尤为重要.

目前《已使用化妆品原料目录》2021 版中已包含视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯6 种类视黄醇物质，但《化妆品安全技术规范》2015 版中并无这6 种物质的检测方法和限量要求.当下对类视黄醇的分析主要采用液相色谱分析法[9-13].刘玉玲等[9]对化妆品中阿达帕林、维甲酸、异维甲酸、维胺酯、他扎罗汀、视黄醇、视黄醇醋酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯9 种成分进行液相色谱分析，该试验以甲醇∶异丙醇（体积比55∶45）为溶剂对视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、他扎罗汀、维胺酯等的提取能力较低，检出能力较差，且未对可能含有这9 种成分的化妆品样品进行测定，方法的可靠性有待考证.与之相比，本文对化妆品中6 种类视黄醇测定的不同与创新之处在于，比较了6 种类视黄醇在不同有机溶剂中的溶解性，研究了不同提取溶剂对6种类视黄醇的提取能力，对类视黄醇的检测具有更低的检出限和更高的提取效果.闫秀芳等[10]对化妆品中视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、羟基频呐酮视黄酸酯、视黄醇视黄酸酯7 种视黄醇衍生物进行液相色谱法研究，其中视黄醇与视黄醛、视黄醇乙酸酯与羟基频呐酮磺酸酯的分离度略差，试验难以重现，且出峰时间较晚，检出能力较差.液相色谱串联质谱法集中于对视黄醇及其衍生物的顺反异构体分析研究[14]，以及视黄醇和其他维生素在生物细胞中的代谢研究[15].可知液相色谱仪已能满足检测要求.本研究拟通过优化前处理条件，建立高效、准确、灵敏的液相色谱法测定化妆品中类视黄醇的含量.

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

仪器：Agilent 1260 Infinity II 高效液相色谱配二 极 管 阵 列 检 测 器（DAD）（Agilent）；色 谱 柱1（Extend-C18 柱，4.6 mm×250 mm, 5 µm，型 号：990967-906，Agilent）；色谱柱2（ZORBAX ODS，4.6 mm×250 mm, 5 µm，型号：880952-702，Agilent）；分析天平（ME204E，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；纯水仪（OQ007XXM1，ELGA）；超声波清洗器（KQ-600E，昆山市超声仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（3-30k，Sigma）.

试剂：四氢呋喃，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；乙酸，液相色谱专用，上海安谱实验科技股份有限公司；标准品：视黄醇纯度95%，视黄醇视黄酸酯纯度98%，上海麦克林生化科技有限公司；视黄醛纯度98%，视黄醇丙酸酯纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；视黄醇乙酸酯纯度95.23%，德国DR EHRENSTORFER 公司；视黄醇棕榈酸酯纯度96%，上海安谱实验科技股份有限公司；二丁基羟基甲苯纯度98.8%，德国DR EHRENSTORFER 公司.化妆品样品购自淘宝.

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm,5 µm），柱温：30 ℃，流动相A：0.5%乙酸水溶液，流动相B：四氢呋喃，采用梯度洗脱程序，具体条件如表1 所列.流速：1.0 mL/min，DAD 检测波长：328、350、382 nm，进样量：10 µL.

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3 试验步骤

1.3.1 配制标准工作溶液

分别称取视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯6种标准品各25 mg 于25 mL 棕色容量瓶中，用四氢呋喃溶解并定容至刻度，摇匀后，得到标准储备溶液，于−18 ℃冰箱锡纸包裹避光保存.

混合标准溶液的配制：准确移取适量标准储备溶液于25 mL 棕色容量瓶中，加入0.05 mL 二丁基羟基甲苯[7]（简称BHT，200 mg/L），用四氢呋喃定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为100 mg/L 的混合标准溶液，于0 ℃冰箱锡纸包裹避光保存.

混合标准工作溶液的配制：分别移取混合标准溶液适量，用水∶四氢呋喃（体积比2∶8）稀释，配制成质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L 的混合标准工作溶液，现配现用.

1.3.2 样品预处理

称取1.0 g（精确至0.001 g）样品，置于10 mL棕色具塞比色管中，加入8 mL 水∶四氢呋喃（体积比2∶8）溶液，涡旋震荡1 min，超声提取20 min，冷却至室温并定容.转移至15 mL 棕色离心管中，以6 000 r/min 离心5 min，经0.22 µm 有机系滤膜过滤，滤液为待测液.

2 结果与讨论

2.1 检测波长的优化

对视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯6 种类视黄醇进行DAD 检测分析.扫描发现视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯的最大吸收波长为328 nm，视黄醛的最大吸收波长为382 nm，视黄醇视黄酸酯的最大吸收波长为350 nm.故确定以328、382、350 nm 为检测波长，按1.2 项仪器工作条件对质量浓度为5 mg/L 的混合标准工作溶液进行检测，其色谱图如图1 所示.

2.2 色谱柱的优化

通过查阅文献发现，维A 酸及其衍生物的痕量分析多采用C18 柱进行分离[3,9,10,12,16].因此本试验对比了Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）和Agilent ZORBAX ODS（4.6 mm×250 mm, 5 µm）两种C18 柱的分离效果.对比发现两种色谱柱出峰时间一致，但在Agilent Extend-C18 色谱柱上6 种物质分离情况更理想，峰形更好，响应更高，故选择该色谱柱进行分析.

2.3 流动相的优化

通过考察文献和标准[16]，可知视黄酸类衍生物多采用甲醇与0.5%乙酸水溶液作为流动相.借鉴后尝试以甲醇∶0.5%乙酸水溶液（体积比9∶1）为流动相运行30 min，只得到重叠的前4 种物质（即视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯），后2 种物质（视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯）并未检出.当改用四氢呋喃∶0.5%乙酸水溶液为流动相时，随着比例的调整，6 种物质得到有效分离.在水相中加入0.5%乙酸，可改善峰形，使得峰对称性更好.另外0.5%乙酸浓度低，在梯度洗脱过程中并不会分解类视黄醇衍生物，在混合标准溶液中添加二丁基羟基甲苯，起到维持目标物稳定的作用.最终确定以四氢呋喃∶0.5%乙酸水溶液为流动相梯度洗脱.

2.4 溶解性试验

由于视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯6 种物质都是弱极性化合物，水∶四氢呋喃混合溶液极性偏大，为确保分离的可靠性，需验证这6 种物质在混合溶液中的溶解性.设计采用不同比例的水与四氢呋喃、甲醇、乙腈、异丙醇混合溶液对同浓度下6 种类视黄醇混合溶液进行溶解，观察溶液是否有析出.按1.3.1 项制备标准工作溶液的方法制备添加二丁基羟基甲苯的混合标准溶液100 mg/L 进行溶解性试验.如表2 所列，水与四氢呋喃的混合溶液对这6 种物质的溶解力最强，水与异丙醇的混合溶液次之，甲醇与水、乙腈与水的混合溶液最弱.特别是当水与四氢呋喃混合溶液比例为2∶8 和3∶7 时对这6 种物质具有良好的溶解性.

表2 不同水-有机溶剂比例的混合溶液对同浓度下6 种类视黄醇的溶解试验Table 2 Dissolution experiments of 6 retinoids at same concentration by mixed solutions with different waterorganic solvents ratios

2.5 提取溶剂的优化

选择空白化妆品膏霜为检测样品，加入相同质量浓度为5 mg/L 的混合标准溶液进行试验，考察6种物质的峰面积.分别以甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃、水∶甲醇、水∶乙腈、水∶异丙醇、水∶四氢呋喃混合溶液提取目标物，每种溶剂平行测定两次，取平均值，结果如表3 所列.由表3 可知，四氢呋喃作为提取溶剂效率优于甲醇、乙腈、异丙醇，其中以水∶四氢呋喃（体积比2∶8）混合溶液作为提取溶剂对6 种目标物的提取结果较为理想，故选择水∶四氢呋喃（体积比2∶8）作为提取溶剂.

表3 不同提取溶剂下6 种目标物的峰面积(n=2)Table 3 Peak areas of 6 retinoids with different extraction solvents (n=2)

混合标准工作溶液、空白样品、空白样品加6种混合标准溶液的叠加色谱图如图2 所示，样品为不含类视黄醇的面霜.图中编号1、4、7，编号2、5、8，编号3、6、9 谱图依次为质量浓度为5 mg/L 的混合标准工作溶液，空白样品，空白样品加5 mg/L 6种混合标准溶液的色谱图.其中，空白样品与空白样品加标按1.3.2 样品预处理、1.2 仪器工作条件进行分析.

图2 混合标准工作溶液、空白样品、空白样品加标色谱图（1）混合标准工作溶液：1、4、7，（2）空白样品：2、5、8，（3）空白样品加标：3、6、9Fig.2 Chromatograms of mixed standard working solutions, blank samples and labeled blank samples(1) lines 1, 4, 7 of mixed standard working solutions, (2) lines 2, 5, 8 of blank samples, (3) lines 3, 6, 9 of labeled blank samples

2.6 线性方程和检出限

在上述色谱条件下，对6 种类视黄醇标准品混合溶液进行高效液相色谱分析.以峰面积（y）为纵坐标，目标物质量浓度（x，mg/L）为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程的线性关系良好，相关系数R2均不小于0.999 93.采用外标法通过线性回归方程对6 种类视黄醇化合物进行定量分析.选取空白化妆品膏霜为基质样品，称取约1.0 g（精确至0.001 g）样品，通过制备加标样品的方式，测定0.5、0.7、1.5、2.1 mg/kg 质量分数下类视黄醇的信噪比(S/N)，每个浓度做3 个平行加标样，根据所得S/N＞3、S/N＞10 分别检测各物质的检出限和定量限，结果如表4 所列.

表4 6 种类视黄醇的线性回归、相关系数、线性范围及方法检出限（n=3）Table 4 Linear regression equations, correlation coefficient, linear ranges and method detection limits of 6 retinoids (n=3)

2.7 回收率和精密度

选择未检出类视黄醇的3 种化妆品基质样品：水剂型、乳液型、膏霜型，各称取样品1.0 g，分别加入类视黄醇混合标准溶液（100 mg/L）0.05、0.5、1.0 mL，使加标质量浓度为0.5、5.0、10.0 mg/L 3 个水平，每种水平做6 个平行样品，按上述样品前处理和色谱条件进行分析，所得回收率与精密度较好，结果如表5 所列.6 种类视黄醇的回收率在91.3%～107.7%之间，相对标准偏差（RSD）在0.9%～4.7%之间，说明该方法具有稳定的回收率和良好的精密度.

表5 6 种类视黄醇的加标回收率和RSDs（n=6）Table 5 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 6 retinoids (n=6)

2.8 样品测定

用建立的方法对市面上商家声称含有类视黄醇的12 种化妆品进行检测，测定结果如表6 所列，阳性样品精华液2 色谱图如图3 所示.其中，晚霜3 未检出视黄醇和视黄醇棕榈酸酯，精华乳2 标签中只标明含有视黄醇，却检出少量视黄醛，精华液3 只检出视黄醇，未检出视黄醇棕榈酸酯，以上3 款皆与标签不符.此外，精华液3 在使用时需要先按压泵头，使保鲜仓内含有视黄醇及其衍生物的精华液释放至肌底精华液中，再通过摇晃瓶身混匀，最后挤压出混合精华液进行涂抹.实际操作过程中，按压泵头的手法会影响泵出的精华液量，导致检测结果平行性较差，影响使用效果，建议商家改进包装，方便精准使用.精华液2 商家声明视黄醇质量分数为1%（其余商家未标注含量），本方法测定质量分数为1.0%，说明本方法可准确测定化妆品中6种类视黄醇含量.精华液4 商家声明采用超分子包裹技术，起到缓释视黄醇的作用，实际测定视黄醇质量分数为0.020%.降低视黄醇浓度、减少刺激的同时，延长作用时间，可保护消费者安全使用类视黄醇，提高该化妆品作用效果.

图3 阳性样品精华液2 谱图Fig.3 Chromatograms of positive sample about essence 2

表6 化妆品中类视黄醇含量测定结果Table 6 Determination results of 6 retinoids in cosmetics/%

3 结论

本研究建立了测定化妆品中视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯6 种类视黄醇的高效液相色谱分析方法.经验证，该方法线性相关性良好，检出限低，可应用于水剂型、乳液型、膏霜型化妆品中，准确分析市售化妆品中这6 种类视黄醇的含量.该方法具有前处理简单、检出限低、回收率高、重现性好、准确性高等优点，为更好的研究化妆品中6 种类视黄醇含量提供技术支持.