超声萃取-气相色谱法测定拟南芥种子中脂肪酸含量

宜原原，罗 云，阮梅林，雷 敏

（华中科技大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉，430074）

油料作物中脂肪酸主要包括棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）等[1-5]，具有很高的经济价值，可加工成食用油及工业用油，是潜在的可再生能源.因此，利用遗传多样性及生物技术途径，对主要油料作物进行脂肪酸组成的全方位改良和培育含特种脂肪酸的油料作物品种，是当前研究的热点[6-7].

在这些研究中，脂肪酸含量和组成是评价油料作物含油量及其营养价值的重要指标之一[1].拟南芥作为模式植物，在很多植物科学领域脂肪酸的研究中具有领衔地位.研究拟南芥种子中脂肪酸的代谢调控机制，有助于揭示植物种子脂肪酸积累的普遍机制，为油料作物分子育种提供基因资源和理论基础，并指导油料作物育种实践[8].为了加快拟南芥种子以及油料作物中脂肪酸代谢调控研究进程，提高脂肪酸检测效率是十分必要的.完整种子甲酯化气相色谱法（whole seed transmethylation-GC, WSTGC）是一种被广泛用于测定拟南芥种子中脂肪酸组成的方法[9-10]，但是该方法脂肪酸萃取时间相对较长.近年来，一些萃取效率高、萃取速度快的技术应用广泛，如微波辅助萃取[11]、加速溶剂萃取[12]、超声萃取[13-14]等.其中超声萃取法无需用到复杂的前处理设备，方便快捷，且超声波产生的空化效应、热效应等可加速目标物质的运动，因而更适用于固体介质的提取.

本文以拟南芥种子为研究对象，在WST-GC 的基础上，联合了超声萃取法，通过优化超声萃取条件、气相色谱检测条件，建立超声萃取-气相色谱测定拟南芥种子中脂肪酸含量的分析方法，并将新建的方法应用于油菜籽、花生、大豆作物中脂肪酸含量的测定.该方法简单、快速，为高效准确地测定拟南芥种子及部分油料作物中脂肪酸含量提供了方法指导.

1 仪器设备及材料方法

1.1 仪器设备

气相色谱仪：Agilent 6850 GC；超声波仪：KS-7200DF，昆山市洁力美超声仪器有限公司；氮吹仪：ZG 系列干式氮吹仪，上海梓桂仪器有限公司.

1.2 材料及试剂

拟南芥种子、油菜籽：由华中科技大学生命科学与技术学院环境资源微生物技术研究所提供.花生、大豆：市售，粉碎后备用.甲醇、甲苯：色谱纯，德国Merck 公司；二丁基羟基甲苯：分析纯，德国Merck 公司；正己烷、石油醚、二氯甲烷：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；石油醚：农残级，沸程40～60 ℃，上海安谱实验科技股份有限公司；硫酸（H2SO4）、无水硫酸钠、氢氧化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司.脂肪酸甲酯混合标准品（25 mg/支）及十九烷酸甲酯（100 mg/支）：上海安谱实验科技股份有限公司.

1.3 优化后的色谱条件

检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；载气：氮气；色谱柱：Agilent DB-23（60 m×0.25 mm，0.25 µm)；进样口温度：280 ℃；进样体积：1 µL；分流比：1∶50；柱温箱升温程序：50 ℃，1 min，25 ℃/min 到175 ℃，2 min，3.5 ℃/min 到230 ℃，5 min；检测器气体流速：氢气为30 mL/min，空气为400 mL/min，尾吹气为30 mL/min.

1.4 标准溶液配制

内标溶液的配制：准确称取十九烷酸甲酯100 mg 至5 mL 容量瓶中，加入正己烷定容至刻度线，溶解后即得到质量浓度为20 mg/mL 的十九烷酸甲酯内标溶液.

脂肪酸甲酯混合标准溶液的配制：准确称取脂肪酸甲酯混合标准品25 mg 至5 mL 容量瓶中，加入正己烷定容至刻度线，溶解后得到质量浓度为5 mg/mL 的脂肪酸甲酯混合标准溶液.

混合标准工作溶液的配制：用移液枪分别移取脂肪酸甲酯混合标准溶液0.8、0.4、0.2、0.1、0.04 mL，加入10 µL 内标溶液，用正己烷定容至1 mL，得到质量浓度分别为4.0、2.0、1.0、0.5、0.2 mg/mL的混合标准工作溶液.

2 结果与讨论

2.1 试验条件的优化

称取5 mg 拟南芥种子，加入1.5 mL 2.5%的H2SO4甲醇溶液（含0.01%二丁基羟基甲苯）、0.6 mL 甲苯溶液和10 µL 十九烷酸甲酯内标溶液.在一定温度下进行超声甲酯化，取出冷却后依次加入1.8 mL 超纯水、1.0 mL 萃取剂混匀，室温静置萃取一定时间后，4 000 r/min 离心5 min，吸取全部上层液体，用无水硫酸钠除水，高纯氮气吹干，加适量萃取剂溶解后定容至1 mL，用0.22 µm 有机相滤膜过滤至进样瓶中，采用气相色谱仪对其进行分析测试.采用单因素试验方法[15]，分别探究甲酯化超声时间、甲酯化超声加热温度、甲酯化超声功率、静置萃取时间、萃取剂种类对甲酯化效率或萃取效率的影响.

2.1.1 甲酯化超声时间

在甲酯化超声加热温度为90 ℃、超声功率为400 W、静置萃取时间为1.5 h、萃取剂为正己烷的条件下，对比不同甲酯化超声时间对酯化效率的影响[16].检测到拟南芥种子中有11 种脂肪酸，分别为C16:0（棕榈酸）、C18:0（硬脂酸）、C18:1n9t（反油酸）、C18:1n9c（油酸）、C18:2n6c（亚油酸）、C18:3n3（α-亚麻酸）、C20:0（花生酸）、C20:1n9（顺-11-二十碳烯酸）、C20:2（顺-11, 14-二十碳二烯酸）、C20:3n3（顺-11, 14, 17-二十碳三烯酸）、C22:1n9（芥酸）.设定超声时间为60 min 时，各脂肪酸酯化效率为100%.采用面积归一化法，计算其他条件相对该条件的酯化效率.对各条件下11 种脂肪酸的相对酯化效率平均值进行比较，结果如图1 所示.由图1 可知，在超声时间为30 min 时，酯化效率达到最高，为104%.说明超声加热30 min 即可满足试验需求，因此选择超声加热时间为30 min.

图1 不同甲酯化超声时间下的相对酯化效率Fig.1 Relative methylation efficiencies at different ultrasonic times

2.1.2 甲酯化超声加热温度

在甲酯化超声功率为400 W、超声加热时间为30 min、静置萃取时间1.5 h、萃取剂为正己烷的条件下，仅改变加热温度，检测拟南芥种子中的脂肪酸酯化效率.设定超声加热温度为90 ℃时，各脂肪酸酯化效率为100%.采用面积归一化法，计算其他加热温度下的相对酯化效率，结果如图2 所示.从图中可以看出，在加热温度为0～90 ℃范围内时，随着温度的增加，酯化效率逐渐增加.加热温度为80和90 ℃的酯化效率分别为77%和100%，90 ℃酯化效率显著高于80 ℃.此外，当加热温度高于90 ℃时，酯化剂显著沸腾导致挥发严重，因此最终选择超声加热温度为90 ℃.

图2 不同甲酯化温度下的相对酯化效率Fig.2 Relative methylation efficiencies at different heating temperatures

2.1.3 甲酯化超声功率

在甲酯化超声加热温度为90 ℃、超声加热时间30 min、静置萃取时间1.5 h、萃取剂为正己烷的条件下，仅改变超声功率，检测拟南芥种子中的脂肪酸酯化效率.当设定超声功率为400 W 时，各脂肪酸酯化效率为100%，计算其他超声功率下的相对酯化效率，结果如图3 所示.由图可知，超声功率为400 W 时脂肪酸酯化效率最高.因此，选择超声功率为400 W.

图3 不同超声功率下的相对酯化效率Fig.3 Relative methylation efficiencies at different ultrasonic powers

2.1.4 静置萃取时间

在甲酯化超声加热温度为90 ℃、超声功率为400 W、超声加热时间30 min、萃取剂为正己烷的条件下，静置萃取不同时间后，4 000 r/min 离心5 min，检测拟南芥种子中的脂肪酸提取效率.设定静置萃取时间为90 min 时，各脂肪酸提取效率为100%，计算其他萃取时间的相对萃取效率，结果如图4 所示.由图4 可见，随着静置萃取时间的延长，提取效率逐渐降低，可能原因是随着静置时间增加，发生了一定程度的反萃取.因此，后续选择不静置萃取直接离心即可.

图4 不同静置萃取时间下的萃取效率Fig.4 Relative extraction efficiencies under different static extraction times

2.1.5 萃取剂种类

在甲酯化超声加热温度为90 ℃、超声功率为400 W、超声加热时间30 min、不静置萃取直接4 000 r/min 离心5 min 的条件下，改变萃取所用溶剂，检测拟南芥种子中脂肪酸提取效果.结果如图5可见，萃取剂为正己烷、石油醚、二氯甲烷时，所检测结果无明显差异，因此后续仍然选择使用正己烷作为萃取剂.

图5 不同萃取溶剂提取结果(1) C16:0, (2) C18:0, (3) C18:1n9t, (4) C18:1n9c,(5) C18:2n6c, (6) C18:3n3, (7) C20:0, (8) C20:1n9,(9) C20:2, (10) C20:3n3, (11) C22:1n9Fig.5 Results of different extraction solvents

综上所述，脂肪酸提取的优化条件如下：甲酯化超声加热温度为90 ℃，超声功率400 W，超声加热时间为30 min，萃取剂为正己烷，加入萃取剂后不进行静置萃取直接4 000 r/min 离心5 min.

2.2 质量保证与质量控制

2.2.1 工作曲线及方法检出限、定量限

用优化后的色谱条件，对脂肪酸甲酯混合标准溶液质量浓度分别为4.0、2.0、1.0、0.5、0.2 mg/mL，内标溶液质量浓度为2 mg/mL 的混合标准工作溶液进行检测.由于拟南芥种子以及常见油料作物中所含的多为十五碳以上的脂肪酸[17]，因此本文重点进行了十五碳至二十四碳脂肪酸的检测.4.0 mg/mL 混合标准溶液检测色谱图如图6 所示.由图6可见，所有组分均能实现较好分离.

图6 脂肪酸甲酯混合标准溶液检测色谱图(1) 十五烷酸，(2) 顺-10-十五烯酸，(3) 棕榈酸，(4) 棕榈油酸，(5) 十七烷酸，(6) 顺-10-十七烯酸，(7) 硬脂酸，(8) 反油酸，(9)油酸，(10) 反亚油酸，(11) 亚油酸，(12) 内标：十九烷酸，(13) γ-亚麻酸，(14) α-亚麻酸，(15) 花生酸，(16) 顺-11-二十碳烯酸，(17) 顺-11, 14-二十碳二烯酸，(18) 二十一烷酸，(19) 顺-8, 11, 14-二十碳三烯酸，(20) 花生四烯酸，(21) 顺-11, 14, 17-二十碳三烯酸，(22) 二十二烷酸，(23) 顺-5, 8, 11, 14, 17-二十碳五烯酸，(24) 芥酸，(25) 顺-13, 16-二十二碳二烯酸，(26) 二十三烷酸，(27) 二十四烷酸，(28) 神经酸，(29) 顺-4, 7, 10, 13,16, 19-二十二碳六烯酸Fig.6 Gas chromatogram of methyl fatty acid components for mixed standard solutions(1) C15:0, (2) C15:1, (3) C16:0, (4) C16:1, (5) C17:0,(6) C17:1, (7) C18:0, (8) C18:1n9t, (9) C18:1n9c,(10) C18:2n6t, (11) C18:2n6c, (12) C19:0 (internal standard), (13) C18:3n6, (14) C18:3n3, (15) C20:0,(16) C20:1n9, (17) C20:2, (18) C21:0, (19) C20:3n6,(20) C20:4n6, (21) C20:3n3, (22) C22:0, (23) C20:5n3,(24) C22:1n9, (25) C22:2, (26) C23:0, (27) C24:0,(28) C24:1n9, (29) C22:6n3

以标准样品浓度为横坐标，各脂肪酸峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，拟合脂肪酸标准曲线，结果如表1 所列.由表1 可得，所构建的标准曲线线性关系良好，相关系数R2均大于0.999 0.以目标物质测试信噪比（S/N）为3 时的质量浓度作为检出限，S/N 为10 时的质量浓度作为定量限.试验结果表明，方法的检出限为2.9～21.5 mg/kg，定量限为14.5～94.0 mg/kg.

表1 标准工作曲线及方法检出限、定量限Table 1 Calibration curves, limits of detection, limits of quantification

2.2.2 方法的精密度

对拟南芥种子中的11 种脂肪酸在所优化条件下重复测定7 次，采用面积归一化法，分别计算各脂肪酸的相对百分含量和相对标准偏差（RSD），进行方法精密度分析，其结果如表2 所列.由表2 可得，所检测的11 种脂肪酸相对百分含量的RSD 在0.5%～7.9%范围内，表明采用超声萃取-气相色谱法对拟南芥种子中脂肪酸含量进行测定的精密度较好.

表2 精密度试验结果Table 2 Experiment results of precision /%

2.3 拟南芥种子及不同油料作物中脂肪酸含量的检测

按照最终优化的试验方法，对拟南芥种子、油菜籽、花生、大豆中的脂肪酸种类及含量进行测定，色谱图如图7 所示，定量结果如表3 所列，证实本文所建立的方法同样适用于多种油料作物脂肪酸的提取检测.

表3 样品定量检测结果Table 3 Quantification results of sample /(mg/kg)

图7 拟南芥种子、油菜籽、花生、大豆中脂肪酸检测色谱图（a）拟南芥种子，（b）油菜籽，（c）花生，（d）大豆Fig.7 Gas chromatograms of Arabidopsis seeds, Rapeseed, Peanut and Soybean

3 结论

在传统的WST-GC 法中，甲酯化反应往往需要在90 ℃高温下持续1.5 h 以上[9-10]，本文联用了超声萃取法后，仅需在90 ℃条件下超声加热30 min，酯化效率便可达到最高，大大缩短了试验时间.此外，在以往的研究中，未见将WST-GC 法用于检测油料作物中脂肪酸的报道，而本文将所建立的方法应用于多种油料作物脂肪酸含量的测定，拓宽了方法的适用性.

综上所述，本文建立了超声萃取-气相色谱测定拟南芥种子中脂肪酸含量的试验方法，该方法操作简单，提取效率高，为快速准确测定脂肪酸含量提供了新思路，有助于加快拟南芥种子中脂肪酸代谢调控机制的研究进程.该方法同样适用于多种油料作物脂肪酸含量的测定，可为油料作物优质高产品种筛选、育种效率提高、产油量性状调控机理的研究、高品质食用油的获取等研究领域脂肪酸含量的精确测定提供指导.