QuEChERS-高效液相色谱/三重四极杆质谱联用法测定化妆品中防晒剂的检测方法

潘秀丽，邵长春，李 赟，许晓辉，王小乔，张虹艳

（兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州 730050）

防晒剂是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保护皮肤免受特定紫外线所带来的伤害或保护产品本身而在化妆品中加入的物质.它能吸收紫外线中可引起人产生急性皮炎（红斑）及皮肤灼伤的波长为280～320 nm 的中波紫外线（即UVB），以及可使皮肤变黑的320～400 nm 的长波紫外线（即UVA）.随着人们生活水平的提高，消费者对化妆品的需求不断增加[1].作为特殊类化妆品，防晒类化妆品中含有的各类防晒剂对人体的安全性和环境的危害性并不相同，因此，一直以来国内外对防晒剂的使用种类和使用量有严格的管理和限制[2-3].

《化妆品安全技术规范》（2015 年版）列出的化学防晒剂的检测方法为高效液相色谱法，但检测费时费力，可操作性欠佳.经查阅文献，目前化妆品中防晒剂的检测方法有气相色谱法[4]、高效液相色谱法[5-11]、静电场轨道阱高分辨质谱法[12]、气相色谱-质谱法[13]和液相色谱-质谱法[14-15]等.液相色谱-质谱法灵敏度高，不用保留时间定性，一针混标就可以检测出目标物，从而实现对其定性和定量，检验效率高，是目前检验中比较高效的一种检测方法.本试验采用三重四极杆液相色谱-质谱联用法，对文献中液相色谱-质谱法中的防晒剂项目和质谱参数以及样品前处理做了一个补充，开发出15 种防晒剂的高通量样品前处理方法和仪器分析方法.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱/三重四极杆质谱联用仪：Agilent 1260+6460，安捷伦科技有限公司；千分之一天平：MS105DU，十万分之一天平：XSE205DU，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；离心机：H1850，湖南湘仪实验室开发有限公司；智能恒温槽：SCG-6，宁波新芝生物科技股份有限公司；IKA 振荡器：VXR，艾卡（广州）仪器设备有限公司；QuEChERS 试剂盒：5982-1010、G7750-10001，安捷伦科技有限公司；HLB 柱：HLB 6cc（500 mg），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；MCX 柱：Oasis MCX 6cc（150 mg），沃特世科技（上海）有限公司（Waters）；FaAEx-AD-001 kits 柱：巨研科技股份有限公司.

甲酸（色谱纯），东京化成工业株式会社；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），默克股份两合公司；乙酸铵（优级纯），天津市凯信化学工业有限公司.

对照品：奥克立林（批号：752831；纯度：98.7%）、苯基苯并咪唑磺酸（批号：C15894540；纯度：93.3%）、对氨基苯甲酸异辛酯（PABA 乙基己酯）（批号：458726；纯度：100%）、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷（批号：1124793；纯度：99.1%）、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮（批号：G1013005；纯度：100%）、3-亚苄基樟脑（批号：CCHM700478；纯度：96.0%），以上对照品生产单位为Dr.Ehrenstorfer 公司；二乙胺基羟苯甲酰基苯甲酸己酯（批号：G139993；纯度：99.4%）、胡莫柳酯（批号：G164621；纯度：98.8%）、二苯酮-3（批号：14971-01；纯度：100%）生产单位为Accustandard；甲酚曲唑三硅氧烷（批号：D679410；纯度：97.3%），生产单位为Toronto Research Chemicals；亚苄基樟脑磺酸（批号：97085；纯度：97.0%）生产单位为SIGMA-ALORICH；对氨基苯甲酸（批号：100017-201704；纯度：99.8%）、4-甲基苄亚基樟脑（批号：800110-202001；纯度：98.4%）生产单位为中国食品药品检定研究院；对甲氧基肉桂酸异戊酯（批号：GOL414；纯度：96.9%）生产单位为美国药典USP；甲氧基肉桂酸乙基己酯（批号：S102885；纯度：99.8%）生产单位为阿尔塔科技有限公司.15 种防晒剂化合物信息如表1 所列.

表1 15 种防晒剂化合物信息Table 1 Informations of 15 sunscreen compounds

样品：试验中所用样品均从西太华、兰州中心、屈臣氏购买，包含美素、铠丽、新碧、佰草集、欧诗漫、花印、露得清、理肤泉、春莹等品牌.

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

Agilent C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）；流动相A 为含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸铵溶液，流动相B 为含0.1%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱；柱温35℃；进样量2 µL；流速0.2 mL/min.梯度洗脱程序如表2 所列.

表2 高效液相色谱流动相条件Table 2 Mobile phase conditions of high performance liquid chromatography

1.2.2 质谱条件

电喷雾（ESI）离子源；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：325 ℃；干燥气流速：6 L/min；喷雾电压：45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4 000 V.其他参数如表3 所列.

表3 15 种防晒剂的质谱条件Table 3 Mass spectrometer conditions of 15 sunscreens

1.2.3 样品前处理

准确称取样品1.0 g（精确到0.001 g）于10 mL具塞离心管中，加入1 mL 无水乙醇，涡旋1 min，用乙腈∶水（体积比为4∶1）定容至刻度，加入QuEChERS 盐包一包，混匀，40 ℃下超声振荡30 min，在0 ℃下于3 900 r/min 离心10 min.吸取离心好的样品溶液3 mL 于QuEChERS 净化管中，涡旋2 min，在0 ℃下10 000 r/min 离心10 min.如要稀释，取上清液，用乙腈∶水（体积比4∶1）进行适当稀释，经0.22 µm 有机滤膜过滤后作为待测溶液.

1.2.4 标准溶液配制

准确称取固体对照品各10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成质量浓度为1 mg/mL 的标准储备液.其中苯基苯并咪唑磺酸标准溶液在加入定容溶剂前，预先加入少量无水乙醇使其溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成l mg/mL 的标准储备液.精密吸取上述各溶液适量，置于容量瓶中用乙腈稀释，配制成胡莫柳酯和亚苄基樟脑磺酸质量浓度为2 µg/mL，其余成分质量浓度为1 µg/mL 的混合标准溶液，于−18 ℃冷冻条件下保存备用.系列标准溶液的配制：取混合标准溶液配制成胡莫柳酯和亚苄基樟脑磺酸质量浓度分别为10、20、40、80、120、200、400 ng/mL，其余成分质量浓度分别为5、10、20、40 、60、100、200 ng/mL的15 种紫外吸收剂的标准系列溶液，混匀后，经0.22 µm 有机滤膜过滤，备用.

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

化妆品规范中使用的提取液是四氢呋喃、高氯酸、甲醇、水.其中，四氢呋喃和高氯酸属于高毒、强刺激性气味的试剂，对身体危害极大，同时四氢呋喃和高氯酸对管路和质谱的损害较大，在质谱检测中是尽量避免使用的.因此优先选择甲醇和乙腈作为提取溶剂，但直接用甲醇和乙腈提取，样品溶解不理想，悬浮物较多.加入1 mL 水，涡旋1 min，再分别用甲醇和乙腈进行提取比较，发现防晒剂的提取效果大大增加，而乙腈对丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷和奥克立林的提取率更好，最后选择用乙腈-水（体积比为4∶1）溶解，为了提高苯基苯并咪唑磺酸的回收率，在样品中先加入1mL 无水乙醇，再用乙腈-水（体积比为4∶1）定容至刻度.

2.2 提取液净化的选择

选择QuEChERS 柱、HLB 柱、MCX 柱、FaAEx-AD-001 kits 柱对样品进行净化比较，回收率较高的为QuEChERS 柱，但是净化效果不太好，增加离心步骤后，杂质沉淀，待测液澄清，经上机检测，柱压稳定，回收率较高，能满足质谱检测要求.使用4 种净化柱净化样品的色谱图如图1 所示.

图1 4 种净化柱处理的样品色谱图（a）QuEChERS 柱，（b）HLB 柱，（c）MCX 柱，（d）FaAEx-AD-001 kitsFig.1 Chromatograms of samples treated with 4 kinds of purification columns

2.3 离心条件的选择

选择冷冻离心机，在0、5、10、25 ℃离心温度下，转速分别为3 900、6 000、8 000、10 000 r/min，分别离心5、10、15 min，发现在0 ℃、10 000 r/min条件下，离心效果最好，这是因为样品乳液密度较小，温度越低，转速越快，样品杂质沉淀越好.离心时间为10 和15 min 时质谱图杂质峰相当，故选择0 ℃、10 000 r/min、离心10 min 作为离心条件.

2.4 流动相选择

首先使用乙腈-水和甲醇-水进行色谱比对，结果表明：使用乙腈-水在梯度洗脱中柱压更低，目标物保留时间更短，分离效果好，同时对泵也有较好的保护作用.其次由于15 种目标物使用的是正离子扫描模式，酸性环境更有利于目标物的质谱响应，故可以在流动相中添加甲酸或乙酸，由于甲酸比乙酸具有更好的挥发性，故选择甲酸作为流动相的调节剂.比较乙腈-水和乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）两种流动相，结果表明：乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸）为流动相其目标物的响应值较好，但是二苯酮-3 和PABA 乙基己酯的峰形较宽，有拖尾.比较乙腈（0.1%甲酸）-2 mmol/L 的乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）和乙腈（0.1%甲酸）-水（0.1%甲酸），发现添加乙酸铵后两种成分的峰形有了明显的改善.故选择乙腈（0.1%甲酸）-2 mmol/L 的乙酸铵水溶液（0.1%甲酸）作为流动相.

2.5 质谱条件优化

采用负离子扫描模式进行SCAN 全扫描，部分目标物找不到离子对，对于找到离子对的目标物进行MRM 检测，响应值很低，达不到检测的需求.采用正离子扫描模式进行SCAN 全扫描，能找到母离子，通过product ion 扫描方式可以找到2种以上定量定性离子对，选用正离子模式来对15种目标物的母离子、子离子、碰撞电压和碰撞能量等质谱参数进行优化，使碎片离子的响应度达到最大，从而确定最优的质谱条件，15 种防晒剂的定性（黑色）、定量（蓝色）离子对色谱图如图2所示.

图2 15 种防晒剂的MRM 图谱Fig.2 MRM spectra of 15 sunscreens（a）OC，（b）PBSA，（c）EHDP，（d）BMDM，（e）4-MBC，（f）IMC，（g）PABA，（h）BP3，（i）BEC，（j）BZ3，（k）DHHB，（l）HMS，（m）DTT，（n）BCSA，（o）EHMC

2.6 各防晒剂的线性关系和检出限

将各成分配制成系列标准溶液，绘制一系列标准曲线，相关系数（R2）不小于0.99 时认为线性关系良好.配制一定质量浓度的标准溶液确定检出限，当检测结果为3 倍信噪比时确定为检出限.各成分标准曲线和检出限结果如表4 所列.试验表明，HMS 和EHMC 在10～400 ng/mL、其余防晒剂在5～200 ng/mL 范围内有良好的线性关系，R2均大于0.99，检出限均不小于10 µg/kg，满足试验要求.

表4 15 种防晒剂的标准曲线和检出限Table 4 Standard curves and limits of detection of 15 sunscreens

2.7 各防晒剂成分的回收率试验

称取一定量的空白样品，加入混合标准溶液，配制成HMS 和BCSA 加入量分别为60、120、240 ng/mL，其余防晒剂成分加入量分别为30、60、120 ng/mL 的3 个浓度水平，每个水平作3 个平行样，以平均值计算回收率.结果如表5 所列.15 种防晒剂在不同水平下的回收率为68.4%～84.2%，相对标准偏差（RSD）为1.7%～9.0%，符合试验对回收率和精密度的要求.

表5 15 种防晒剂的回收率及相对标准偏差Table 5 Recoveries and relative standard deviations of 15 sunscreens

3 结论

本研究使用QuEChERS 前处理技术结合高效液相色谱/三重四极杆质谱联用仪，测定防晒类化妆品中奥克立林、苯基苯并咪唑磺酸等15 种防晒剂，可在15 min 内完成对防晒剂的分离测定，所选用的提取试剂替代了传统毒性较大的四氢呋喃和高氯酸.该方法前处理简单，回收率高，QuEChERS 柱净化能满足质谱对样品的要求，适用于化妆品中15种防晒剂的定性定量分析，能满足市场监管部门对防晒类化妆品的监督要求.