3733例双胎无创产前筛查结果及其与年龄等相关因素的分析

屠豪炎，江 元，卢寨娥

宁波市妇女儿童医院产科，浙江宁波 315012

染色体非整倍性是引起婴儿出生缺陷、导致先天性残疾甚至死亡的一个重要因素。根据2009年国家出生缺陷监测中心数据显示，我国的出生缺陷患病率较世界平均水平高，达4%～6%[1]。近年来，随着辅助生殖技术的不断应用，高龄孕妇率增加，多胎发生率尤其是双胎率明显增加，从而导致相关并发症的增加，数据表明双胎的染色体非整倍性发生率较单胎高，其筛查也受诸多因素干扰[2-3]。传统的产前血清学筛查效果双胎不如单胎，其存在检出率低及假阳性率高的问题[4]；而羊水穿刺虽是金标准，但流产、早产及宫内感染等风险高于单胎，是许多孕妇不能接受的。因此，需要一种高效、安全、无创的双胎筛查方案。无创产前筛查技术(non-invasive prenatal testing，NIPT)已经在单胎妊娠中得到广泛应用，对T21、18、13具有较高的准确性和灵敏度[5]。国际产前诊断及美国妇产科医师学会初步通过了NIPT在双胎妊娠的应用，我国双胎妊娠产前筛查与诊断技术(2017)指出，有经验的产前诊断机构，双胎T21综合征的筛查可以选择NIPT，其检出率目前可达93.7%以上，假阴性率为0.23%，而对于T18、13、性染色体及染色体微缺失/重复的数据有限，需要更多的研究[6-8]。本研究通过回顾性分析3733例NIPT检测结果，初步探讨NIPT在双胎染色体异常中的临床价值及其对年龄等相关因素的影响。

对象和方法

对象选取2018年1月至2022年12月在宁波市妇女儿童医院接受NIPT检查的双胎孕妇3733例，所有孕妇均签署知情同意书。纳入标准：(1)12～26+6周在超声提示下宫内双胎孕妇；(2)所有受检者均符合2016年《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》，在1年内未接受过异体输血、细胞治疗、器官移植等；(3)所有孕妇均自愿接受检查。对所有NIPT提示高风险的孕妇均记录羊水穿刺核型结果、超声结果等。本研究获宁波市妇女儿童医院医学伦理委员会批准(伦理审查编号：2016伦审字第5号)。

NIPT检测采集孕12～26+6周双胎孕妇外周血样10 ml于EDTA抗凝管中，4℃保存，并在6 h内分离血浆，按照核酸提取试剂盒操作说明书从中提取游离DNA，通过末端修复、接头连接、PCR扩增和文库定量等，依托Ion Proton平台，使用BioelectronSeq4000高通量测序仪进行高通量基因测序，测序结束后，用无创产前管理软件分析数据计算Z值。结果采用Z值进行风险评分，正常区间(低风险)为-3

产前诊断经NIPT提示高风险的孕妇，建议通过羊水穿刺术进一步检查，取20 ml羊水或1 ml脐带血样本对每例病例进行细胞培养和染色体核型分析，根据国际人类细胞遗传学命名体系(ISCN2016)染色体核型描述及诊断，如发现染色体微缺失或微重复，建议行染色体核型分析加染色体微阵列。以上均经宁波市妇女儿童医院产前诊断门诊诊断及知情同意后操作。另部分孕妇至外院产前诊断中心行产前诊断。产后新生儿未见异常者为阴性。

随访对纳入信息的所有孕妇均进行追踪随访，宁波市妇女儿童医院产检和分娩孕妇经电子病历系统查阅，外院产检孕妇进行电话随访，随访内容有孕期超声检查、产前诊断结果、胎儿妊娠结局、出生缺陷等信息，随访至产后3个月。

统计学处理采用IBM SPSS 25.0软件进行统计分析，计数资料以例数及百分数(%)表示，年龄、孕周等计量资料结果先确定是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，非正态分布的计量资料用中位数(最大值～最小值)表示；组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验，双侧P<0.05为差异有统计学意义，其中多重组间比较采用Bonferroni法校正检验水准(本研究α校正值为0.0083)。

结 果

NIPT人群特征对2018年1月至2022年12月在宁波市妇女儿童医院接受NIPT检查的3733例双胎孕妇进行统计分析，并按年龄、孕周、绒毛膜性及受孕类型进行分组归纳。其中年龄组分为<30岁、30～34岁、35～39岁及≥40岁组，孕周组分为≤13+6周、14～17+6周、18～21+6周及22～26+6周组，绒毛膜性组分为双绒毛膜双羊膜囊(dichorionic diamniotic，DCDA)、单绒毛膜双羊膜囊(monochorionic diamniotic，MCDA)及单绒毛膜单羊膜囊(monochorionic monoamniotic，MCMA)组，受孕类型分为辅助妊娠及自然受孕组。结果显示NIPT阴性<30岁1780例、30～34岁1591例、35～39岁284例、≥40岁7例，NIPT阳性<30岁30例、30～34岁23例、35～39岁9例、≥40岁9例；NIPT阴性≤13+6周1029例、14～17+6周2183例、18～21+6周387例、22～26+6周63例，NIPT阳性≤13+6周8例、14～17+6周39例、18～21+6周18例、22～26+6周6例；NIPT阴性DCDA 2348例、MCDA 1285例、MCMA 29例，NIPT阳性DCDA 55例、MCDA 16例、MCMA 0例；NIPT阴性辅助妊娠1893例、自然受孕1769例，NIPT阳性辅助妊娠40例、自然受孕31例。失访53例均为NIPT阴性：其中年龄<30岁21例、30～34岁13例、35～39岁19例，孕周≤13+6周8例、14～17+6周21例、18～21+6周18例、22～26+6周6例，绒毛膜DCDA 32例、MCDA 11例、MCMA 10例，辅助生殖29例、自然受孕24例。纳入NIPT高风险71例、低风险3609例。纳入产妇的平均年龄为(29.5±4.1)岁，平均孕周为(15.3±2.2)周；双胎妊娠大多数为DCDA，达64.38%；自然妊娠的孕妇占48.22%，因不孕而行辅助妊娠的孕妇占51.78%。

胎儿染色体高风险筛查结果纳入统计的3680例孕妇中，NIPT提示高风险者共71例，包括13例T21高风险、19例T18高风险、5例T13高风险、18例性染色体异常及16例染色体微缺失/重复。50例孕妇接受羊水穿刺诊断，21例拒绝羊水穿刺。羊水穿刺提示29例异常，其中10例T21(8例DCDA、2例MCDA)，11例T18(9例DCDA、2例MCDA)，3例T13(均为DCDA)，3例性染色体异常(2例DCDA、1例MCDA)，2例染色体微缺失/微重复(均为MCDA)，21例未见异常(表1)。经随访，21例拒绝羊水穿刺的孕妇确诊3例为T18(3例均为DCDA)，2例为T21(1例MCDA、1例DCDA)，所有低风险孕妇经随访确定新生儿健康。

表1 71例无创产前筛查技术高风险孕妇染色体异常筛查结果及妊娠结局

NIPT总体灵敏度为100%，特异度为98.99%，阳性预测值(positive predictive value，PPV)为47.89%(34/71)，其中T21、18、13的总PPV为78.38%(29/37)。其中T21的PPV最高，达92.30%，其次为T18，为73.68%，T13仅为60%；性染色体异常的PPV为16.67%，染色体微缺失/重复的PPV为12.50%。NIPT对T21、T18、T13、性染色体及微缺失/重复的灵敏度均为100%，特异度分别为99.97%、99.95%、99.95%、99.59%、99.64%，误诊率分别为0.03%、0.05%、0.05%、0.41%、0.36%，漏诊率均为0。

NIPT结果与双胎孕妇年龄及孕周的相关性根据年龄及孕周，将3733例双胎孕妇分为≥40岁(16例)、35～39岁(274例)、30～34岁(1601例)及<30岁(1789例)4个年龄组以及≤13+6(1029例)、14～17+6(2201例)、18～21+6(387例)、22～26+6(63例)4个孕周组，初步探讨不同年龄、孕周的灵敏度、特异度、阳性预测值、误诊率及漏诊率。对于总染色体异常，在不同年龄段(≥40岁中真阳性数6例、假阳性数3例，35～39岁中真阳性数5例、假阳性数4例，30～34岁中真阳性数13例、假阳性数10例，<30岁中真阳性数10例、假阳性数20例)，NIPT在真阳性数的检出上差异有统计学意义(P<0.001)，≥40岁组与其他3组比较差异均有统计学意义(Bonferroni校正，P均<0.001)，而35～39岁、30～34岁、<30岁组之间两两比较差异均无统计学意义(Bonferroni校正，P均>0.0083)；孕周方面(≤13+6周中真阳性数3例、假阳性数5例，14～17+6周中真阳性数20例、假阳性数19例，18～21+6周中真阳性数8例、假阳性数10例，22～26+6周中真阳性数3例、假阳性数3例)，在不同孕周阶段中，NIPT在真阳性数的检出上差异有统计学意义(P<0.001)，但14～17+6周与18～21+6周差异无统计学意义(Bonferroni校正，P=0.078)。NIPT在各年龄段的灵敏度均为100%，特异度依次为70.00%、98.51%、99.37%、98.88%，PPV依次为66.67%，55.56%，56.52%，33.33%，误诊率依次为30.00%、1.49%、0.63%、1.12%，漏诊率均为0；在不同孕周的灵敏度均为100%，特异度依次为99.51%、99.13%、97.36%、95.00%，PPV依次为37.50%、51.28%、44.44%、50.00%，误诊率依次为0.49%、0.87%、2.64%、5.00%，漏诊率均为0。单独对不同年龄段T21、18、13的NIPT结果进行分析(≥40岁中真阳性数6例、假阳性数0例，35～39岁中真阳性数5例、假阳性数1例，30～34岁中真阳性数10例、假阳性数2例，<30岁中真阳性数8例、假阳性数5例)，结果显示≥40岁组与其他3组比较差异均有统计学意义(Bonferroni校正，P均<0.001)，而35～39岁、30～34岁、<30岁组之间两两比较差异均无统计学意义(Bonferroni校正，P均>0.0083)，不同年龄段的灵敏度均为100%，特异度依次为100%、99.63%、99.87%、99.72%，PPV依次为100%、83.33%、83.33%、61.54%，误诊率依次为0、0.37%、0.17%、0.29%，漏诊率均为0；单独对不同孕周阶段T21、18、13的NIPT结果进行分析(≤13+6周中真阳性数3例、假阳性数3例，14～17+6周中真阳性数18例、假阳性数1例，18～21+6周中真阳性数5例、假阳性数1例，22～26+6周中真阳性数3例、假阳性数3例)，4组不同孕周真阳性数的检出差异有统计学意义(P=0.004)，其中≤13+6、14～17+6及18～21+6孕周之间两两比较差异均无统计学意义(Bonferroni校正，P均>0.0083)，各组灵敏度均为100%，特异度依次为99.70%、99.95%、99.74%、95.24%，PPV依次为50.00%、94.74%、83.33%、50.00%，误诊率依次为0.30%、0.05%、0.26%、4.76%，漏诊率均为0。

NIPT对不同绒毛膜性染色体异常的初步分析结果71例高风险双胎孕妇中，55例为DCDA双胎(10例T21，9例真阳性；14例T18，12例真阳性；3例T13，均为真阳性；15例性染色体异常，2例真阳性；13例染色体微缺失/重复，无真阳性)，16例为MCDA双胎(3例T21，均为真阳性；5例T18，2例真阳性；2例T13，无真阳性；3例性染色体异常，1例真阳性；3例染色体微缺失/重复，2例真阳性)。NIPT显示DCDA和MCDA的染色体高风险率分别为2.32%和1.24%，但对真阳性数的检出差异无统计学意义(P=0.256)。在DCDA双胎组中，高风险最多的是性染色体异常，MCDA双胎组中为T18，但在真阳性数上，T21和T18分别为两组最多。DCDA双胎筛查高风险孕妇平均年龄为(32.0±5.6)岁，平均孕周为(16.4±2.3)周，其中真阳性孕妇平均年龄为(33.5±4.9)岁，平均孕周为(16.7±3.0)周；MCDA双胎筛查高风险组孕妇平均年龄为(30.3±6.0)岁，平均孕周为(16.7±3.4)周，其中真阳性孕妇平均年龄为(30.4±6.7)岁，平均孕周为(16.7±1.8)周。两组年龄及孕周差异均无统计学意义(P均>0.05)。

NIPT对不同受孕类型染色体异常的初步分析结果71例高风险双胎孕妇中，40例为辅助妊娠(10例T21，9例真阳性；11例T18，7例真阳性；3例T13，均为真阳性；5例性染色体异常，2例真阳性；11例染色体微缺失/重复，2例真阳性)，31例为自然受孕(3例T21，均为真阳性；8例T18，7例真阳性；2例T13，无真阳性；13例性染色体异常，1例真阳性；5例染色体微缺失/重复，无真阳性)。NIPT显示辅助妊娠和自然妊娠的染色体高风险率分别为2.10%和1.80%，但对真阳性数的检出差异无统计学意义(P=0.114)。在辅助妊娠双胎组中，高风险最多的是T18及染色体微缺失/重复，其次是T21；自然受孕中高风险最多的是性染色体异常，其次是T18。但在真阳性数上，T21与T18均为两组最多。辅助妊娠双胎筛查高风险孕妇平均年龄为(32.4±5.3)岁，平均孕周为(16.5±2.5)周，其中真阳性孕妇平均年龄为(33.3±5.0)岁，平均孕周为(16.4±2.7)周；自然妊娠双胎筛查高风险孕妇平均年龄为(30.6±6.1)岁，平均孕周为(16.5±2.7)周，其中真阳性孕妇平均年龄为(31.8±6.5)岁，平均孕周为(17.2±3.1)周。两组年龄及孕周差异均无统计学意义(P均>0.05)。

讨 论

近年来，NIPT在单胎中已被广为研究，尤其是在T21、18、13的筛查中具有高灵敏度、高特异度及低假阳性率的特点，且美国医学遗传和基因组学会指出，NIPT能够在不同年龄人群中替代传统的非整倍体筛查方法[9-10]，但其在双胎的检测应用中缺乏大量研究。2012年Canick等[11]对25例双胎进行了NIPT筛查，高风险中7例T21、1例T13灵敏度及特异度均为100%，无假阳性结果。2013年Lau等[12]及2017年Fosler等[13]分别对12、115例双胎进行NIPT筛查，T21的灵敏度及特异度均为100%，均提示NIPT在双胎中的准确性。此外，比较历年国内已发表的研究，NIPT检测双胎T21、18、13的灵敏度分别为97.3%～100%、90.9%～100%、100%[14-16]。2019年薛淑文等[17]对625例双胎行NIPT筛查，T21、18的检出率分别为66.7%和100%，总检出率为83.3%，阳性预测值为100%，假阳性率为0，首次检测成功率97.92%，与同期单胎比较差异无统计学意义，提议将NIPT作为双胎妊娠孕妇拒绝产前诊断时首选的胎儿染色体非整倍体筛查的方式。本研究显示NIPT对双胎孕妇的T21、18的灵敏度均为100%，PPV为92.3%、73.68%。本研究T13的灵敏度为100%，PPV仅为60%，这可能与T13常早期累及颅脑、颜面部、颈部、心脏等全身诸多部位异常相关，宁波市妇女儿童医院产前诊断中心在纳入NIPT检查时，常规行胎儿B超检查，部分异常情况已被超声发现，直接行羊水穿刺而未行NIPT检查。

染色体微缺失/微重复是除非整倍体异常的另一类致新生儿出生缺陷的因素，结合国内外文献提示NIPT在单胎中对常染色体微缺失、微重复的检测中有一定的可行性，但总体的PPV较低[18-20]，在双胎中的研究更少有报道。陈邵宁等[21]对2473例双胎研究显示，31例高风险中14例为微缺失/微重复，其中8例经产前诊断只确诊2例，PPV为25%；Cheng等[22]在1048例双胎中发现13例高风险中微缺失1例，微重复2例，经产前诊断微缺失1例。本研究71例高风险中16例为微缺失/微重复，经产前诊断确诊2例，灵敏度为100%，PPV为12.50%，较上述研究更低。结合以上研究，提示NIPT对双胎儿染色体微缺失/微重复的阳性预测值较低，临床上应用需谨慎。

绝大多数的性染色体非整倍体异常(sex chromosome aneuploidy，SCA)在孕期超声检查中不会有明显表型异常，往往伴随其他异常的筛查而偶然发现[23]。美国医学遗传和基因组学会指出NIPT可扩展至SCA中的筛查，且较多的研究显示NIPT对检测胎儿SCA具有不错的潜能[9，23-25]。而在双胎中，NIPT对SCA的筛查并不稳定。Yang等[26]报道432例双胎NIPT检测结果，性染色体方面仅1例为高风险，且产前诊断证实为假阳性，Cheng等[22]在1048例双胎中发现7例SCA高风险，但产检诊断证实均为假阳性。本研究纳入的3733例双胎产妇中，18例为SCA高风险，经产前诊断确诊3例，15例假阳性，PPV仅16.67%。因此，NIPT对双胎SCA的筛查效果并不令人满意，但不失为一种警示作用。

在单胎中，NIPT对年龄因素的检测能效已得到诸多证实，其检出35岁以下孕妇胎儿非整倍体的灵敏度和特异度可达100%；对于高龄单胎产妇，有研究显示NIPT对于T21、18、13同样具有极低的漏诊率[27-29]。因此，NIPT能够显著减少非高龄和高龄孕妇的侵入性产前诊断。然而，目前国内单就年龄因素对NIPT在双胎中检测能效的影响鲜有报道，仅李珊珊等[30]发现不同筛查年龄组孕妇外周游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)浓度与单胎比较差异无统计学意义。本研究显示NIPT在不同年龄段双胎胎儿染色体异常的检出上，≥40岁组与其他3组比较差异有统计学意义，其PPV达66.67%，但误诊率也较高，达30%，进一步对T21、18、13分析显示，≥40岁组与其他3组比较差异有统计学意义，其PPV为100%，这可能与此次高龄(≥40岁)孕妇总数少相关，但提示NIPT在双胎高龄(≥40岁)中有一定的检出能效。此外，在T21、18、13中，NIPT在35～39岁、30～34岁、<30岁组之间对真阳性数的检出上差异无统计学意义，各组PPV依次为83.33%、83.33%、61.54%，误诊率依次为0.37%、0.17%、0.29%，漏诊率均为0，灵敏度均为100%，一定程度上提示在不同年龄段(<40岁)双胎中，NIPT有相同的检出能效，具有极低的误诊率和漏诊率。由于本研究≥40岁及35～39岁组样本量较少，存在一定的偶然性，临床上还需进一步大样本的研究来明确。

孕妇外周血中的游离cfDNA比例与孕周呈正相关，在双胎中也不例外[31]。孕周过早可能会导致外周血中游离cfDNA含量不足，从而产生假阴性结果。本研究NIPT显示总染色体异常在不同孕周组间差异有统计学意义，但14～17+6周与18～21+6周之间差异无统计学意义，提示NIPT检查需要合适的孕周，具体结果为孕14～17+6周组的PPV最高(51.28%)，依次为孕22～25+6周(50.00%)、孕18～21+6周组(44.44%)。孕22～25+6周的PPV高于孕18～21+6周，可能是一部分阳性病例无法继续妊娠或者早期超声等发现已终止干预，导致22～25+6周受检人数下降，从而影响PPV。单对T21、18、13异常检出的分析中，孕14～17+6周组的PPV达94.74%，其次为18～21+6周(83.33%)，且发现≤13+6、14～17+6及18～21+6孕周之间差异无统计学意义，这可能与双胎孕妇早期外周血中的游离cfDNA含量较同期单胎孕妇高相关。虽然本研究在孕周分组上未细分DCDA双胎及MCDA双胎，但发现孕14～17+6周及18～21+6周组的PPV值均较高，在一定程度上验证了最新《双胎妊娠产前筛查与诊断技术规范》中MCDA双胎取样时间为14～18周，DCDA双胎取样时间为16～22周。因此，在恰当的孕周行NIPT检查，可以给患者更多的决策时间。

通过NIPT的筛查，本研究显示辅助妊娠中DCDA双胎的比率高于自然妊娠，染色体异常在DCDA双胎为2.32%，高于MCDA双胎的1.24%，但对真阳性数的检出差异无统计学意义。同时，结果显示T21、18是两组中最常见的非整倍体，大部分异常结果发生在DCDA双胎中的1个胎儿，这与之前的研究报道[16，31]一致。但多数染色体异常发生在DCDA双胎中可能和本研究的总体样本量少相关，多种因素无法统计分析，如人群中存在选择偏倚，多数辅助受孕为DCDA双胎。

目前，关于双胎辅助妊娠中NIPT检测效能的报道较少，部分研究显示双胎中T21的PPV在辅助妊娠中高于自然受孕，T18、T13及性染色体异常的PPV与自然妊娠相比差异无统计学意义[32-33]。本研究T21的PPV在辅助妊娠中略低于自然妊娠，但对T21的检出上两组比较差异无统计学意义；T13、性染色体及染色体微缺失/重复的PPV辅助妊娠中高于自然妊娠。NIPT对自然妊娠及辅助妊娠总染色体异常检出方面差异无统计学意义，这与Yu等[31]的报道相一致。虽然本研究的染色体高风险病例较少，但仍提示NIPT在双胎辅助妊娠具有一定的检出效能，对辅助生殖类双胎进行更大、更全面阳性样本的临床研究将是进一步的研究方向。

综上，本研究显示NIPT在双胎中具有较高的准确性，对不同年龄、孕周都具有高敏感性和高特异性的优点，尤其是对T21、18、13。虽然NIPT对单绒双胎及双绒双胎的染色体异常检出效率差异无统计学意义，但染色体异常多发生于双绒双胎中。不论辅助妊娠还是自然受孕，都可行NIPT筛查，对T21异常的检出率最高。因此，将NIPT作为双胎妊娠孕妇筛查染色体异常的首选方式有一定的可行性，但广泛应用还需大人群基数研究。