子痫前期14，15-EET、15-HETE 表达及妊娠结局分析*

杨佳琪，曹雪燕，薛云薇，施 建，黄 华，苏 敏**

（南通大学附属医院1 妇产科；2 酶学实验室；3 病理科，江苏 226001）

妊娠高血压疾病（hypertensive disorder of pregnancy，HDP）是发生在妊娠20 周后的妊娠期特有疾病，HDP 孕妇子痫前期（preeclampsia，PE）发病率3%～8%。花生四烯酸（arachidonic acid）代谢产物是血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖、凋亡等的重要调节因子，与血管功能紊乱性疾病相关[1]。当细胞处于应激状态下，花生四烯酸通过磷脂酶A2 和磷脂酶C的作用，从磷脂中游离出来。游离花生四烯酸通过3条代谢途径合成具有强大生物学功能的脂质分子：（1）通过环氧化酶（COX）途径代谢为前列腺素和血栓素；（2）通过脂氧化酶（LOX）途径转化为白三烯；（3）通过不同细胞色素P450（CYP450）酶代谢成为环氧二十碳三烯酸（EETs）和20-羟基二十碳四烯酸（20-HETEs）[2]。本研究应用液相色谱联合质谱分析检测子痫前期患者胎盘中花生四烯酸19 种代谢产物，采用酶联免疫吸附实验检测妊娠高血压疾病孕妇血清14，15-EET 及15-HETE 水平，分析14，15-EET及15-HETE 在妊娠高血压疾病发生发展中的作用及其与妊娠结局的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年1 月在我院住院分娩的子痫前期孕妇6 例和正常分娩孕妇6 例，留取胎盘组织。选取2018 年1 月—2020 年12 月在我院产检和住院分娩的妊娠期高血压疾病孕妇149 例（其中妊娠期高血压53 例，子痫前期51 例，重度子痫前期45 例）为观察组，同期正常健康孕妇50 例为对照组。子痫前期诊断标准参照人民卫生出版社第9 版《妇产科学》[3]，排除合并原发性高血压、血液疾病、糖尿病、心血管疾病、肾病、感染性疾病。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱联合质谱检测胎盘组织花生四烯酸代谢产物：胎盘娩出后立即用刀片切取胎盘母体面近脐带插入部（尽量避开梗死和钙化的区域）组织约50 mg，用PBS 冲洗，加入250 μL 甲醇和5 μL 甲酸，混匀后匀浆，冰浴中超声波破碎，吸取上清液。加入350 μL 双蒸水和0.5 mL 乙酸乙酯，涡旋30 s，离心10 min 取出有机相。氮气吹干，甲醇复溶。应用Waters BEH-C18 柱色谱柱，流动相：甲醇∶0.1%甲酸水90∶10。应用液相色谱联合质谱检测19 种花生四烯酸代谢产物：环氧化酶（COX）代谢产物前列腺素PGD2、PGE2、PGF2α、8iso-PGF2α、15-dPGJ2，血栓烷11-d-TXB2，油酸产物9-HODE、13-HODE 和17S-HODE，脂氧化酶（LOX）代谢产物5-HETE、12-HETE、15-HETE 和白三烯LTB4，细胞色素P450（CYP） 代谢产物5，6-DHET、8，9-DHET、11，12-DHET、14，15-DHET、14，15-EET 和20-HETE。

1.2.2 血清14，15-EET 及15-HETE 水平测定：采集各组孕妇静脉血，离心取血清，置于-70 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清14、15-EET及15-HETE 水平，试验前从低温冰箱取出血清融冻，按试剂盒说明书加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止，以450 nm 波长测量吸光度（OD 值）。

1.3 不良妊娠结局判定标准 （1）围产儿死亡（宫内死亡或引产、新生儿死亡）；（2）新生儿出生后入住NICU；（3）出生极低体重；（4）娩出后5 min Apgar 评分＜7 分；（5）宫内生长受限；（6）新生儿呼吸窘迫综合征；（7）胎盘早剥；（8）羊水过少；（9）产后出血；（10）HELLP 综合征；（11）心力衰竭。出现以上任何一种情况即视为不良妊娠结局。

1.4 统计学处理 应用SPSS 20.0 统计学软件进行数据处理分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子痫前期组与对照组胎盘花生四烯酸代谢产物表达比较 子痫前期患者胎盘中14，15-EET、15-HETE 及9-HODE 含量较对照组增多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 子痫前期组与对照组胎盘花生四烯酸代谢产物表达比较 ng/mL

2.2 各组孕妇血清14，15-EET 及15-HETE 水平比较 重度子痫前期组、子痫前期组、妊娠期高血压组、对照组血清14，15-EET 及15-HETE 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度子痫前期组高于子痫前期组、妊娠期高血压组和对照组，子痫前期组高于妊娠期高血压组和对照组，妊娠期高血压组高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组孕妇血清14，15-EET 及15-HETE 水平比较

2.3 重度子痫前期不同妊娠结局孕妇血清14，15-EET、15-HETE 表达水平比较 对照组50 例中出现不良妊娠结局1 例（2.00%）（早产儿），妊娠期高血压组53 例中出现不良妊娠结局4 例（7.54%）（早产儿3 例，低体重儿2 例，产后出血2 例，新生儿转NICU 2 例，新生儿窒息1 例），子痫前期组51 例中出现不良妊娠结局12 例（23.53%）（早产儿7 例，新生儿转NICU 6 例，低体重儿5 例，新生儿窒息1 例，胎盘早剥1 例，产后出血2 例，羊水过少1 例），重度子痫前期组45 例中出现不良妊娠结局20 例（44.44%）（新生儿转NICU 14 例，早产儿15 例，低体重儿7 例，新生儿窒息2 例，胎盘早剥2 例，产后出血5 例，羊水过少3 例）。将重度子痫前期组分为不良妊娠结局组20 例及正常妊娠结局组25 例，妊娠不良结局组血清14，15-EET 及15-HETE 水平分别为203.97±24.82 pg/mL 和217.00±35.15 pg/mL，高于妊娠正常结局组的179.07±20.67 pg/mL 和182.90±30.25 pg/mL，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨论

部分子痫前期患者病情进展迅速，血压难以控制，严重者可进展为子痫，母婴死亡率较高。目前通过对高危因素（高龄、妊娠期高血压疾病史或家族史、产前体质量指数超标、抗磷脂抗体阳性[4]、子宫动脉多普勒血流检测异常等）评估来预测妊娠期高血压疾病发生的风险，但缺乏快速、经济、有效的生化检测方法。

CYP450 是庞大的酶代谢超级家族[5]，CYP2J 亚家族（如CYP2J2）以及CYP2C 亚家族（CYP2C8 和CYP2C9）成员是代谢产生EETs 的主要酶类，EETs有5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET 和14，15-EET等4 种异构体。EETs 半衰期短，生成后很快被可溶性表氧化物水解酶（sEH）降解为生物活性较低的5，6-二羟基-20 碳三烯酸（DHET）、8，9-DHET、11，12-DHET 和14，15-DHET。LOX 根据氧分子插入花生四烯酸的位置不同而分为4 种亚型：5-LOX，8-LOX，12-LOX 和15-LOX，可催化花生四烯酸生成5/8/12/15-HETE、15-HETE 等产物，通过促进细胞内Ca2+超载引起外周血管收缩，并增强其它血管活性物质的缩血管作用，从而促进高血压的发生。这些花生四烯酸代谢产物作为PI3K/AKT、MAPK 等信号通路的上游调控因子，参与血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖、迁移及凋亡的调控，同时作为内源性血管舒张因子，介导血管的收缩功能。EETs 和HETEs功能、代谢异常，易致血管功能紊乱性疾病如高血压等的发生[6]。

本研究结果显示，子痫前期患者胎盘中CYP 代谢产物14，15-EETs、LOX 代谢产物15-HETE、COX代谢产物9-HODE 的含量较对照组增多，差异均有统计学意义（P＜0.05）。血清14，15-EET 及15-HETE水平重度子痫前期组高于子痫前期组、妊娠期高血压组和对照组，子痫前期组高于妊娠期高血压组和对照组，妊娠期高血压组高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。随着妊娠期高血压疾病的进展，血清中14，15-EET 及15-HETE 水平呈上升趋势，提示这些花生四烯酸代谢产物与妊娠期高血压疾病的发生及病情进展有关。

14，15-EET 在妊娠子宫的胎盘、滋养细胞、羊膜、绒毛膜、蜕膜和肌层中均有形成，在胚胎-胎盘中升高较血浆更显著[7]。有研究表明，妊娠期高血压疾病患者胎盘及蜕膜中CYP2J2 表达升高，可促进胎盘中EETs 的合成和分泌，与母胎循环改变有关[4]。能否通过靶向调节妊娠高血压疾病动物模型14，15-EET 含量，达到舒张血管、改善母胎循环及不良妊娠结局的目标需要进一步研究。

内皮细胞增殖和凋亡失衡干扰血管重铸的建立，血管重铸受15-HETE 等多种花生四烯酸代谢物的影响。HETEs 对子宫螺旋动脉内皮细胞及平滑肌细胞的作用可能引起滋养细胞入侵障碍，造成子宫螺旋动脉重铸不足，加重胎盘缺血缺氧。缺氧诱导15-脂质氧化酶（15-LOX）催化花生四烯酸生成15-HETE，15-HETE 通过抑制Kv 通道引起动脉血管收缩[8]。子痫前期患者因缺氧诱发母体及胎盘同时合成15-HETE。本研究结果显示，15-HETE 在妊娠期高血压疾病患者血液及胎盘组织中15-HETE 增高。细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）对15-HETE 调控人脐血管内皮细胞血管调节作用是必要的，可能是治疗血管调节相关疾病的潜在靶点。

本文研究结果显示，妊娠不良结局患者血清14，15-EET 及15-HETE 水平高于妊娠正常结局患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。有研究表明子痫前期15-HETE 升高与EETs 密切相关，新生儿脐带血EETs 浓度是母体循环的3～5 倍，胎儿脐带血血气分析提示其PCO2与胎盘血浆EETs 水平呈正相关，提示14，15-EET 及15-HETE 和新生儿低氧血症及酸中毒有关。14，15-EET 及15-HETE 通过对母胎界面的影响，可能参与妊娠期高血压疾病不良妊娠结局的发生发展。

综上所述，花生四烯酸代谢产物14，15-EET 及15-HETE 参与妊娠期高血压疾病的病理生理过程，重度子痫前期孕妇血清中14，15-EET 及15-HETE增高与妊娠不良结局有关，提示通过检测孕妇血清14，15-EET 及15-HETE 水平可能有助于预测妊娠不良结局和母婴预后。