载rhBMP-2 聚乳酸/磷酸钙支架在兔脊柱融合中的应用

2024-01-05曹雪华岳述荣刘昌胜

华东理工大学学报(自然科学版) 2023年6期

王萌，张爽，王靖，曹雪华，岳述荣，刘昌胜

（1.上海瑞邦生物材料有限公司, 上海 201707；2.华东理工大学材料科学与工程学院, 上海 200237）

脊柱融合术是目前治疗脊柱退变性疾病的常用手术方法[1-2]，而植骨未融合等是脊柱融合术后需要二次手术的常见原因[3]。如何提高脊柱融合率、减少二次手术、减轻患者痛苦，成为急需解决的问题。通过植骨使脊柱达到骨性融合，是脊柱融合术成功的关键[4]，因此提高植骨材料的骨诱导活性从而促进骨性融合具有重要意义[5]。目前自体骨移植由于其诱导成骨活性作用好，仍是骨移植材料的金标准，但由于其获取来源有限、患者痛苦增加、手术时间延长等原因，临床使用受到限制[6]。

重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2, rhBMP-2）是一种具有骨诱导活性的生长因子，能够快速有效诱导成骨[7-8]，已被广泛用于脊柱融合手术[9-12]。目前临床上可用于脊柱融合的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）产品主要以胶原或磷酸钙盐为载体。以胶原为载体的BMP-2 产品主要为美敦力INFUSE Bone Graft，在2002 年通过美国FDA 批准用于脊柱融合，临床治疗效果良好。但其存在降解过快、植入初期rhBMP-2 突释等不足，可能导致并发症的产生[13-14]。Cho 等[15]研究了负载rhBMP-2 的羟基磷灰石（HA）用于腰椎横突间融合的安全性和有效性，研究发现，当rhBMP-2 使用剂量为0.1 mg/kg 时，患者未出现rhBMP-2 引起的并发症，且能够在3 个月时形成脊柱融合。但是单纯的无机材料作为rhBMP-2 载体存在脆性大、植入后降解慢等缺点。

本文通过有机/无机复合的思路，以临床应用广泛的医用高分子材料聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）和无机材料β-磷酸三钙（β-TCP）为主要成分制备有机/无机复合多孔支架，使材料具有合适的降解速率；并负载rhBMP-2 使该支架具有骨诱导活性，进一步通过羟丙甲基纤维素（HPMC）涂覆于支架表面使rhBMP-2 缓释，延长rhBMP-2 诱导骨修复的时间，促进新骨持续生成。通过兔脊柱融合植骨实验评价了HPMC改性的载rhBMP-2 聚乳酸/磷酸钙支架应用于脊柱融合的可行性。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）、磷酸氢二铵（（NH4)2HPO4）、氨水（NH3·H2O ）、无水乙醇（C2H5OH）：分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司；外消旋聚乳酸（PDLLA）、PCL：医用级，山东省药学科学院中试厂；二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化钠（NaCl，380～550 μm）：分析纯，永华化学科技（江苏）有限公司；HPMC：医用级，山东聊城阿华制药有限公司；rhBMP-2：医用级，上海瑞邦生物材料有限公司。

1.2 测试与表征

pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司，PHS-3C 型；电子天平：上海恒平科学仪器有限公司，MP5002 型；磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，H01-1A 型；马弗炉：上海钜晶精密仪器制造有限公司，SXL-1700C 型；冷冻干燥机：上海田枫实业有限公司，TF-FD-1PF 型；电导率仪：上海仪电科学仪器股份有限公司，DDS-307A 型；Micro-CT：德国Bruker 公司，SkyScan1076 型；电子万能试验机：美特斯工业系统（中国）有限公司，CMT2503 型；倒置显微镜：德国莱卡公司，DMi8 型；扫描电子显微镜：日本日立公司，S-3400N 型；X 射线衍射仪：日本理学电机，D/max2550VB/PC 型。

1.3 实验步骤

1.3.1 支架制备通过物理混合法和氯化钠颗粒占位造孔法制备聚乳酸/磷酸钙多孔支架，将rhBMP-2 溶液吸附于支架表面，冷冻干燥得到载rhBMP-2 的支架，再将表面涂覆HPMC 涂层，得到HPMC 改性的载rhBMP-2 支架。

（1）β-TCP 粉末制备采用液相沉淀法制备β-TCP 粉末。称取280.20 g Ca(NO3)2·4H2O 溶于2.40 L纯化水，配制得到钙溶液。称取104.30 g (NH4)2HPO4溶于1.58 L 纯化水，配制得到磷溶液。将氨水和纯化水按体积比1∶1 混合，得到氨水溶液。制备时，将钙溶液以10 mL/min 的速率滴入磷溶液中，同时滴加氨水溶液使反应体系pH 保持在7.0，待滴加完毕，室温继续反应3 h。反应结束后过滤，将滤饼用无水乙醇洗涤3 遍并烘干，800 ℃煅烧2 h，自然降温至室温后取出，得到β-TCP 粉末。采用X 射线衍射仪对β-TCP 粉末进行分析，扫描范围10°～80°，工作电压40 kV，工作电流100 mA。

（2）聚乳酸/磷酸钙多孔支架制备将医用级外消旋聚乳酸和聚己内酯以质量比1∶1 溶解于二氯甲烷中，加入β-TCP 粉末并磁力搅拌至分散均匀，待溶剂挥发至溶液黏稠时加入NaCl 颗粒，搅拌均匀后填入聚四氟乙烯模具（25 mm×5 mm×3 mm），自然挥发24 h 后脱模。将所得样品浸泡于纯化水中，每4 h 换一次水。当浸泡样品的水溶液电导率低于20 μS/cm时，取出支架，37 ℃烘干12 h，得到聚乳酸/磷酸钙多孔支架。PDLLA、PCL、β-TCP 粉末、NaCl 颗粒的质量比为12∶12∶16∶3。通过扫描电子显微镜观察支架形貌，喷金时间40 s，工作电压10 kV。

（3）载rhBMP-2 聚乳酸/磷酸钙多孔支架制备将上述制备的多孔支架经25 kGy 辐照灭菌后，在无菌环境下将200 μL rhBMP-2 溶液（1 mg/mL）均匀滴加在支架表面，冻干后得到载rhBMP-2 多孔支架。

（4）HPMC 改性的载rhBMP-2 聚乳酸/磷酸钙多孔支架制备将HPMC 溶于纯化水中制备成w=2%的水溶液，并用0.22 μm 无菌过滤器过滤。在无菌环境下，将200 μL rhBMP-2 溶液（1 mg/mL）均匀滴加在支架表面，待完全吸附后，将HPMC 溶液滴在支架表面，冻干后得到HPMC 改性的载rhBMP-2 多孔支架。

1.3.2 脊柱融合实验本文拟通过兔后外侧L5-L6 横突间植骨融合模型[16-17]，考察聚乳酸/磷酸钙多孔支架对脊柱融合的可行性。实验分为4 组，即聚乳酸/磷酸钙多孔支架组（Scaffold，S），载rhBMP-2 的聚乳酸/磷酸钙多孔支架组（Scaffold/rhBMP-2，S/B），HPMC 改性的载rhBMP-2 多孔支架组（Scaffold/rhBMP-2/HPMC，S/B/H）和自体髂骨组（Autogenous iliac crest bone graft，ICBG）。选择3 月龄普通级雄性新西兰大白兔共56 只，每组14 只，体重2.5～3.0 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供并饲养，分别在植骨融合术后28 d、56 d 和84 d 处死取材。

（1）植入手术实验在无菌环境下操作。植入材料分别为多孔支架（图1（a））和自体髂骨（图1（b））。取后正中入路，双侧旁开约2 cm 经椎旁肌肉间隙暴露L5 和L6 横突（图1（c）），去除横突部分皮质后植入材料（图1（d）），逐层缝合。术后连续3 d 予抗生素注射。饲养期间定期观察动物的饮食等一般情况以及切口局部情况，期间动物自由摄食。

图1 兔后外侧脊柱融合植入示意图Fig.1 Illustration of rabbit posterolateral spinal fusion

（2）micro-CT 扫描观察术后分别在28 d、56 d和84 d 处死动物，取出腰椎植骨部位（图1（e）），经w=4%多聚甲醛固定后，使用micro-CT 机对植骨区域进行扫描分析。仪器工作电压49 kV，电流200 μA，分辨率36.5 μm。通过SkyScan CTVOX 2.1 软件进行三维重建，观察新骨生成情况。

（3）Van Gieson（VG）染色样本经w=4% 多聚甲醛固定后，甲基丙烯酸甲酯（PMMA）包埋、切片、磨片最终得到约40 μm 的切片，通过Van Gieson（VG）染色液染色，显微镜观察组织形态。

（4）生物力学采用电子万能试验机对各组实验节段的前屈、背伸活动度进行检测，并对实验节段进行拉伸分离实验，比较各组的椎体融合情况。

进行屈伸实验前，修整脊柱标本使其前后面平整。将标本固定在电子万能试验机的固定装置上，使其处于固定装置的中央。探头移动速率设置为1 mm/min，探头最大应力达10 N 时停止测试，记录此时探头的位移量。对脊柱标本分别进行前屈、背伸测试。

进行拉伸分离实验前，去除脊柱标本的椎间盘，在椎体间分别向上、向下置入两根医用钢丝，将钢丝两端固定在万能试验机的拉伸装置上，探头移动速率设置为10 mm/min。实验过程中检测到的最大拉伸应力值即为实验节段的断裂力，并记录对应的位移量。

（5）统计学分析所有数据采用Origin (OriginLab Corp., Northhampton, MA, USA)进行分析，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学比较，在大于95%的置信水平时，实验数据之间差异具有统计学意义（p< 0.05）。

2 结果与讨论

PLA 是一种被广泛应用的医用高分子材料，在体内可通过水解作用降解，但其不具有骨传导作用，且降解时会降低局部组织的pH，不利于骨修复[18-19]。因此，本文通过在聚乳酸中引入β-TCP 来改善因降解产生的酸性[20]，并提高支架亲水性，以此赋予支架良好的骨传导能力。由于PLA 本身具有一定的刚度，添加柔韧性较好的PCL 可使多孔支架具有可塑性，避免因受力而断裂[21-22]。通过负载rhBMP-2赋予支架骨诱导性，并进一步通过表面涂覆HPMC使rhBMP-2 能够缓慢释放。前期研究表明，HPMC 表面涂层改性的载rhBMP-2 聚乳酸/磷酸钙支架具有较好的诱导成骨作用[23]。本文通过兔后外侧横突间植骨融合实验，证明了该支架用于脊柱融合可达到与自体骨相近的融合效果，可作为自体骨的替代选择。

2.1 支架表征

图2（a）为制备的β-TCP 粉末XRD 图谱，与磷酸三钙（PDF 粉末衍射卡9-169）的主要衍射峰一致。图2（b）为聚乳酸/磷酸钙多孔支架形貌图，可以观察到支架内部丰富的多孔结构，孔径范围200～500 μm。从图2（c）可以观察到，支架骨架上粒径约1 μm 的β-TCP。支架丰富的多孔结构为新骨生成提供了有利条件。

图2 聚乳酸/磷酸钙支架表征Fig.2 Characterization of polylactic acid/calcium phosphate scaffolds

2.2 micro-CT

从图3 所示的三维重建和二维截面图中可以看出，聚乳酸/磷酸钙支架（S）在植入体内后28 d 已发生降解，84 d 时横突间有少量新骨生成；载rhBMP-2 支架（S/B）和HPMC改性的载rhBMP-2支架（S/B/H）在28 d 时支架内部已有新骨生成，84 d 时横突间形成了连续的骨组织结构，表现出良好的融合效果；自体髂骨（ICBG）植入后28 d 时与横突开始融合，84 d 时L5-L6 间达到融合。

图3 材料植入后兔脊柱的Micro-CT 重建图Fig.3 Micro-CT reconstruct images of the rabbit spine post-operation

图4 所示为各组在不同时期的植骨区骨体积分数和骨密度定量分析。从图中可以看出， S/B 和S/B/H 组的骨体积分数和骨密度在不同时间点均高于S 组，说明rhBMP-2 的释放诱导了新骨快速生成。在第56 d 和84 d 时， S/B/H 组的骨体积分数与骨密度高于S/B 组，最接近ICBG 组的融合效果，说明rhBMP-2的缓慢释放进一步提高了材料的促成骨作用。

图4 Micro-CT 定量分析Fig.4 Quantitative analysis of micro-CT

2.3 VG 染色

图5 为材料植入后84 d 组织切片VG 染色图，图中黑色部分为植入材料，红色为骨组织。白色虚线上部为材料植入区域，白色虚线下部为脊柱横突骨组织。在降解方面，从图5 可见S 和S/B 组支架均发生了明显的降解，而S/B/H 组由于存在HPMC 涂层，降解较S、S/B 组慢。在成骨方面，S 组新骨生成作用有限， S/B 组在交界处可见明显新生骨组织， S/B/H组内部生成的新生骨组织最多。

图5 材料植入84 d 时组织切片VG 染色Fig.5 VG staining of bone tissue at 84 d

2.4 生物力学

通过考察融合节段的刚度和拉伸强度来评价融合效果。图6（a）所示为材料植入84 d 后脊柱前屈和背伸的挠度，以万能试验机探头应力达到10 N 时探头的位移量表示。由图可得ICBG 组前屈和背伸的挠度最低，说明ICBG 组脊柱刚度最大，融合效果最好。在3 组支架材料中， S/B/H 组前屈和背伸的挠度最接近于ICBG组，表明S/B/H 组的融合效果最接近于自体骨。

图6 材料植入后84 d 脊柱生物力学分析Fig.6 Biomechanical evaluation of spines at 84 d post-operation

图6（b）所示为材料植入84 d 后脊柱的拉伸强度，以断裂时力与相应位移的比值表示。从图6（b）可以看出，ICBG 组的拉伸强度最高，融合效果最好。3 组支架材料中， S/B/H 组的拉伸强度高于S 组和S/B 组，且最接近ICBG 组，说明S/B/H 释放的rhBMP-2 能够有效促进横突间新骨生长而进一步提高融合效果，可作为自体骨的替代物。

从micro-CT、VG 染色和生物力学结果可以看出，单纯聚乳酸/磷酸钙支架促进成骨的作用有限；支架负载rhBMP-2 后使横突间形成了明显的骨小梁结构，成骨量显著增加；HPMC 涂层改性使支架能够缓慢释放rhBMP-2[23]，延长rhBMP-2 的作用时间，持续有效的诱导成骨作用使HPMC 涂层改性的载rhBMP-2支架在生物力学方面达到了接近自体骨的融合效果，能够使椎体间形成骨性融合。

rhBMP-2 优异的诱导成骨作用已经得到了大量基础研究及临床应用的证实[12,24-26]，但其安全性也越来越引起重视。据报道，rhBMP-2 相关的副作用包括炎症、破骨细胞介导的骨吸收、脂肪化等，尤其在应用于颈椎融合时，易出现颈部肿胀和吞咽、呼吸困难，但目前仍存在争议[27]。目前rhBMP-2 相关副作用的报道以胶原海绵载体为主，应用在脊柱融合时每融合节段使用剂量高达4.2～12 mg[28]，且rhBMP-2在胶原海绵上主要为扩散释放模式，停留时间为5 d 左右[29]。因此，rhBMP-2 副作用的产生可能与过高的使用浓度或过快的释放速率有关[14]。Wen 等[30]总结了2003 年至2017 年rhBMP-2 应用于颈椎融合的有效性和并发症情况，发现rhBMP-2 剂量越高越易出现并发症，推荐使用剂量为每节段0.7 mg。在控制使用剂量的同时，控制释放速率也很关键。本文制备的HPMC 改性载rhBMP-2 支架中rhBMP-2 随HPMC 涂层的降解而缓慢释放，前期研究显示，7 d时rhBMP-2 体外释放量累计为50%，且始终保持较低的释放速率，而未经HPMC改性的支架7 d 时rhBMP-2 体外释放量为70%[23]。因此，以HPMC 涂层改性的聚乳酸/磷酸钙支架体系作为rhBMP-2 载体，不仅具有良好的可降解性和骨传导性，而且在发挥持续有效的骨诱导作用的同时，可避免因rhBMP-2 局部浓度过高而可能产生的不良反应。