DCN通过VEGF因子抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的实验研究

鞠文博，鞠欣达，刘岩峰 （北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013）

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，对女性的健康构成极大的威胁。因此乳腺癌新治疗手段的研究一直是医学研究领域的热点。当前早期乳腺癌的临床治疗方法是以手术治疗为主，然后辅以放化疗，预后差、复发率高。最理想的治疗方法就是靶点的基因治疗[1]。

核心蛋白聚糖（decorin，DCN）是小分子蛋白多糖，含有丰富的亮氨酸，含有1 个44 kD 左右的核心蛋白和1 条硫酸皮肤素侧链[2]，是国际生物医学科研的一个热点。而研究最广泛的是DCN 对癌症细胞的抑制性作用。利用DCN 作为有效的抑癌元素，通过病毒介导的方式开发有效的、有临床应用潜力的基因治疗手段[3]。DCN 是细胞外基质的重要成分，其主要作用有：促进细胞增殖与分化、维持细胞外基质蛋白的生物活性、防止组织器官纤维化等重要作用[4]。DCN 在生物体微环境中分布广泛，也广泛分布于正常组织和肿瘤组织内，因此有其抗肿瘤作用。其主要通过调控受体功能来影响肿瘤细胞的生物活性，这些受体与细胞生长、细胞存活有一定相关性[5]。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与血管的生成有关[6]。肿瘤的转移以及在转移部位的生长主要依赖于肿瘤血管的形成；肿瘤内新生血管是肿瘤细胞早期侵袭的目标，也是肿瘤转移的主要途径。VEGF 能够促进肿瘤内血管生成，使微血管的通透性增加，加强诱导血管及淋巴管内皮细胞的有丝分裂，诱导形成新的血管和淋巴管，为肿瘤向淋巴管转移提供结构基础[7]。

本实验通过DCN 转染乳腺癌MCF-7 细胞，观察DCN 高表达对VEGF 的调控作用，以期发现DCN 通过对VEGF 调控作用，影响乳腺癌MCF-7 细胞的增殖作用，为乳腺癌基因靶点治疗探明机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MCF-7 细胞株（Bio Vector）；Annexin V FITC APOPTOSIS DTEC KITⅠ（BD，美国），Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）；兔抗人DCN 抗体（美国）；MMLV 反转录试剂盒（Takara，Japan）；pcDNA TM 5/FRT 载体（Invitrogen，USA）；鼠抗人GAPDH（Bioworld，美国）；pcDNA3.1-DCN（锐博，广州）；人DCN质粒（柯雷生物）；定量反应体系SYBRPremix Ex Taq（Takara，Japan）。

1.2 细胞培养

复苏后的MCF-7细胞RPMI1640培养基中，添加10%胎牛血清，37 ℃细胞培养箱中培养，24 h 换液，观察细胞密度达到90%时，采用胰酶消化法传代，取第3~5 代细胞进行相关实验。取MCF-7 细胞平均分为2 组，正常培养MCF-7 细胞为对照组，转染质粒高表达DCN的MCF-7细胞为DCN组[8]。

1.3 Lipo2000转染质粒诱导细胞高表达DCN

以阳离子脂质体Lipofectamine 2000 为载体，转染到内含DCN 的cDNA 节段，以及FRT 位点的pcDNA™35/FRT质粒载体至MCF-7细胞中。细胞培养后，检测稳定高表达DCN 的MCF-7 细胞各项指标。

1.4 流式细胞仪检测细胞数量

接种MCF-7 细胞到6 孔板，MCF-7 细胞应处于转染后对数生长期，细胞继续生长，密度达到30%~50%时，筛选DCN 转染的MCF-7 细胞。转染细胞72 h 后，500 μL 的结合缓冲液加入5×105个细胞悬浮，后再加入Triton FITC 荧光标记单克隆抗体（fluorescein-isothiocyanate）5 μL 摇匀，然后加PE（phycoerythrin）5 μL 混匀，无光线条件下反应5~15 min。用流式细胞仪（Becton IDickinson Co.）检测细胞数目。

1.5 MTT法检测MCF-7细胞增殖

换液当天开始计时，7 d 后检测。检测时，吸去所有孔中的培养基，于每孔加入培养液200 μL，后加入20 μL MTT，混合均匀，孵育3~4 h于恒温细胞培养箱中。吸去每孔培养基后，每孔加入DMSO 100 μL，继续恒温孵育5~10 min。吸溶液到另一个准备好的干净的96 孔板中，连续光谱微孔板在光波波长490 nm下测每孔溶液的OD值，记录结果[9]。

1.6 VEGF基因表达检测

转染24 h 后24 孔板细胞使用TRlzl 提取各组细胞总RNA 进行RT-PCR 检测。基因VEGF 引物：上游5' -AATCGAGACCCTGGTGGACA-3'，下游5' -TTAACTCAAGCTGCCTCGCC-3'。 取RNA 体积为50 μL，然后按照RT-PCR 试剂盒方案：45 ℃条件，45 min 进行反转录反应。PCR 反应条件：94 ℃2 min，反转录酶灭活和RNA/cDNA 引物预变性；94 ℃30 s，52.5 ℃1 min，68 ℃2 min，共重复40次；最后1 次68 ℃持续7 min。在2%琼脂糖凝胶上进行RT-PCR 产物电泳，紫外摄像系统中照相，天能分析软件光密度扫描各条带，检测各组VEGF mRNA RTPCR 产物，及对应的内参GAPDH mRNA RT-PCR 产物A值，分析AVEGF/AGAPDH 的比值[10-13]。

1.7 Western blot 法检测细胞转染后MCF-7 细胞VEGF蛋白表达

DCN转染的MCF-7细胞用含血清及胰岛素的培养基制成单细胞悬液后，1×106个细胞/皿，接种于中培养皿中，培养24 h 后，更换为无血清含胰岛素的培养基48 h，用40 ℃PBS 冲洗细胞3 次，预先将蛋白酶抑制剂cocktail 按1∶100 加入细胞裂解液RIPA 中混匀。加入适量RIPA 冰上裂解30 min，将裂解产物刮下收集于EP 管，12 000 r/min，40 ℃离心15 min。吸取上清液，BCA 法蛋白定量后，50 μg 蛋白经12%SDSPAGE 胶分离后转移到PVDF 膜上，含5%牛奶的TBST 溶液封闭1 h。分别孵育对应一抗4 ℃过夜。TBST 洗膜5 min，共3 次，室温孵育二抗1.5 h。TBST洗膜每次10 min，共3 次。ECL 发光底物曝光显影。ImageJ 1.39 U 分析目的条带的光密度值。以GAPDH作为内参，实验重复4次。

1.8 统计学处理

应用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，计量结果采用的方式进行描述，不同组数值比较均采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养结果

图1为MCF-7细胞培养图片，转染DCN后MCF-7细胞增殖能力较对照组减弱，相同培养周期DCN组细胞数目较对照组减少。

图1 DCN转染MCF-7 24、48、72 h细胞生长情况Fig.1 MCF-7cells transfected with DCN for 24、48、72 h

2.2 流式细胞术检测细胞数量

结果显示MCF-7 细胞转染DCN 后分别继续培养24、48、72 h，与对照组相比较，DCN 组MCF-7细胞数量较对照组明显减少，P＜0.05，见表1。

表1 流式细胞仪检测MCF-7细胞数量Tab.1 The flow cytometry measures the number of MCF-7 cells

2.3 MTT法观察各组细胞存活率MTT

结果显示，与对照组相比较，DCN 组细胞存活率明显下降，增殖能力受到显著抑制，P＜0.05，见图2。

图2 MTT法检测MCF-7Fig.2 Prpliferation of MCF-7 cells was detected by MTT

2.4 RT-PCR检测MCF-7细胞VEGF表达

转染24 h后提取总RNA，电泳见图3。结果显示DCN 组细胞培养24 h 后VEGF mRNA 表达水平相较对照组有降低趋势。

图3 VEGF mRNA电泳图Fig.3 VEGF mRNA electropherogram

2.5 Western blot法检测VEGF蛋白表达

细胞转染DCN 后继续培养24 h，Western blot 法检测MCF-7 细胞中VEGF 蛋白表达水平。结果显示，与正常对照组比较，DCN 组MCF-7 细胞中VEGF蛋白表达水平降低，见图4。

图4 Western blot法检测转染后细胞内VEGF蛋白表达Fig.4 Western blot detection of VEGF protein expression in transfected cells

3 讨论

本研究采取基因克隆重组技术等分子生物学实验方法，以人乳腺癌MCF-7细胞为宿主细胞，构建了一个能够表达核心蛋白聚糖基因的稳定高效筛选系统，将已有的正常核心蛋白聚糖cDNA 中表达相应氨基酸的基因进行点突变。通过亚克隆技术，将含有突变基因的cDNA 以及正常核心蛋白聚糖cDNA 克隆到含有FRT 位点的pcDNA™5/FRT 载体中，从而得到多个能高效表达变异核心蛋白聚糖的细胞株。

QT-RTPCR 技术检测正常及变异核心蛋白聚糖在Flip-In 定点整合和表达系统中mRNA 水平的表达；Western Blot 方法检测正常及变异的核心蛋白聚糖在Flip-In 定点整合和表达系统中蛋白水平的表达。MTT技术检测正常和变异基因对MCF-7细胞的增殖活性的影响；结果显示，DCN 转染乳腺癌MCF-7细胞，DCN 在乳腺癌细胞内高表达后，细胞生长受到抑制。

有研究认为，VEGF 因子是与肿瘤淋巴管生成和淋巴道转移密切相关的。Karkkainen 等[14]研究发现，剔除VEGF 基因的小鼠持续出现组织和淋巴水肿而不缓解。VEGF 因子可能与肿瘤细胞的异型增生和分化有关系[15]，VEGF 因子可以引起癌细胞与宿主细胞间相互作用[16]，通过细胞自身分泌的方式，VEGF因子调节、保护和刺激内皮细胞增殖、刺激胚胎干细胞和造血干细胞分化。分子作用机理，研究者[17]认为，VEGF 因子通过与受体VEGFR-2/VEGFR-3 结合，使受其发生自身磷酸化（认为是酪氨酸激酶信号系统），信号经过细胞内传导，诱导DNA 有丝分裂增强，增强细胞增殖以及淋巴管出芽生长；细胞内具体的信号传导途径，有待进一步研究。VEGF 因子导致淋巴管生成以及肿瘤组织由淋巴转移的作用是多方面的[18-20]，深入研究VEGF 因子的作用机理以及传导途径，对更加深入地认识肿瘤以及淋巴道转移机理，指导肿瘤的基因治疗都具有重要意义。