双氢青蒿素对胃癌SGC-7901细胞凋亡和侵袭能力的影响

刘师兵，董长松，朱文赫，于 洋，林 松，高金昌 （.吉林医药学院科研实验室，吉林 吉林 303；.吉林医药学院附属四六五医院消化内科，吉林 吉林 303）

双氢青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物[1]，相比于青蒿素，DHA的水溶性更好、生物利用度更高，更容易代谢[2]，且对正常组织细胞的毒性很低[3]。随着青蒿素类药物在临床治疗中的广泛应用，其对多种肿瘤细胞的抑制和杀伤作用也得到了关注。研究表明，DHA 对白血病、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、逆转肿瘤细胞耐药性、抑制肿瘤新生血管形成等多种细胞毒作用[3]。DHA 对胃癌细胞是否也有类似作用成为研究的焦点。本研究通过检测DHA 对胃癌SGC-7901 细胞增殖、形态变化、凋亡数量、侵袭能力以及相关蛋白表达的影响，初步探讨DHA 在SGC-7901 细胞凋亡和侵袭方面的作用及其可能机制。

1 仪器与试剂

1.1 研究对象

细胞株：胃癌SGC-7901 细胞由吉林医药学院科研实验中心提供。

主要仪器：LAS X 激光共聚焦扫描显微镜（德国Leica 公司）；Microfuge 16 型离心机（Sigma 公司）；MCO-20AIC 二氧化碳培养箱（日本三洋公司）；550型酶标仪（美国BIO-RAD 公司）；MUSETM 细胞分析仪（美国EMD Millipore 公司）；蛋白电泳印迹系统（美国BIO-RAD公司）。

主要试剂：IMDM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Bax、Bcl-2、caspase-3、VEGF（均购自Biosharp 广州硕谱生物科技有限公司）；CCK-8（北京碧云天生物技术公司）；Hoechst 33258 染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；基质胶（美国Corning公司）。

1.2 细胞实验

1.2.1 细胞培养与分组

使用含有10%胎牛血清的IMDM 培养基，将SGC-7901 细胞放入恒温37℃、CO2浓度为5%的培养箱中常规培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，每2 d传代1 次。根据IC50数据将细胞分为空白组和DHA 低（40 μmol/L）、中（80 μmol/L）、高剂量组（120 μmol/L）。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活力

取对数生长期的SGC-7901 细胞接种于96 孔板中，用含有10%胎牛血清的IMDM 培养基混匀细胞，接种浓度约为1×104个细胞/孔，每孔终体积为100 μL，常规培养24 h；用DMSO 溶解DHA 为100 mmol/L，再用IMDM 培养基稀释成不同浓度（25、50、75、100、150 μmol/L），分别加入孔板中，每个浓度重复4 个孔，继续培养24 h 后弃去培养基；用IMDM稀释的CCK-8加入孔板中，3 h后使用酶标仪检测。

1.2.3 Hoechst染色法观察细胞形态变化

接种细胞于6 孔板中，常规培养24 h；根据分组加入相应浓度的药物，继续培养24 h；弃去培养基，加入4%多聚甲醛，常温下固定10 min。弃去固定液，用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次间隔3 min。加入终浓度为10 mg/L 的Hoechst 33258 染液染细胞核5 min。用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次间隔3 min。激光共聚焦显微镜下观察细胞核形态变化。

1.2.4 Transwell侵袭实验

选择生长状态良好，融合度达70%~80%的细胞，按分组加入相应剂量的DHA，培养24 h。用4 ℃预冷的基质胶与IMDM 按1∶8 的比例进行混合，每个小室滴加60 μL 稀释后的基质胶并置于24 孔板中，将孔板放入细胞培养箱内聚合3 h。加药后的细胞用0.01 mol/L PBS 液洗2 次，消化、离心收集，再用无血清的IMDM 混悬并离心（1000 r/inm，3 min），以清洗细胞表面的胎牛血清。细胞计数后，每个小室内加入密度为2.5×105的细胞200 μL，下室加入胎牛血清浓度为15%的IMDM 500 μL。继续培养48 h 后，进行结晶紫染色。镜下观察细胞侵袭情况，每组取5个视野进行拍照、计数，取平均值。抑制率=[1-（穿出基质胶的细胞数/原细胞数）]×100%。

1.2.5 Western blot 法检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF蛋白表达

取对数生长期细胞，根据实验分组加入低、中、高浓度的DHA，培养24 h 后弃去培养基，消化、离心收集细胞。加入含有蛋白酶抑制剂（PMSF）的RIPA蛋白裂解液150 μL，超声细胞粉碎仪超声细胞2 次，每次3~5 s，4 ℃放置30 min，蛋白裂解液充分裂解细胞后，高速台式冷冻离心机离心收集上清液。蛋白定量，SDS-PAGE 结束后，将蛋白转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，PBST 洗3 次，加入1∶1000 的Ⅰ抗，4 ℃过夜。次日PBST 洗3 次，加入HRP 标记的Ⅱ抗（1∶2000），室温摇床孵育1.5 h；PBST 洗5 次，ECL 显色，扫描记录。以β-actin 作为内参照，采用Quantity One 软件进行分析处里，以目标蛋白与内参照蛋白的吸光度比值表示蛋白的相对表达量。

1.2.6 流式细胞术

取对数生长的HepG2细胞接种于6孔板中，接种浓度约为2×105个细胞/孔，常规培养24 h，根据不同药物处理组给药，继续培养24 h 后，胰蛋白酶消化并收集细胞，800 r/min 离心5 min 后弃去上清液，加入IMDM 培养液混悬细胞，使细胞浓度约为1×106个细胞/mL，将细胞原液与MUSETM Annexin-V 凋亡细胞检测试剂1∶1 混匀，避光孵育20 min 后用MUSETM细胞分析仪检测。

1.3 统计学分析

实验数据采用（）表示，SPSS 19.2 软件进行统计学分析处理，实验数据均重复3 次，组件比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双氢青蒿素对胃癌细胞增殖的影响

CCK-8检测结果表明，DHA 能够抑制SGC-7901细胞增殖，随着给药浓度的增加，SGC-7901 细胞活力下降，与空白组比较差异具有统计学意义（P<0.05），即细胞增殖活力与浓度呈负相关。计算IC50为（78.89±0.10）μmol/L，见图1。参考此数据，进行实验分组，DHA 低、中、高剂量组加药浓度分别为40、80、120 μmol/L。

图1 双氢青蒿素对胃癌细胞增殖的影响Fig.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 DHA对SGC-7901细胞核形态的影响

Hoechst 33258 是一种可以穿透细胞膜的膜透性荧光染料，在嵌入双链DNA后释放蓝色荧光，故正常细胞和中早期凋亡细胞均可着色。实验结果显示，低、中、高剂量组的SGC-7901 细胞的细胞核，不同程度地出现固缩和破裂，荧光强度随药物浓度增加而增强。见图2。

图2 DHA对SGC-7901细胞核形态的影响（200×，bar=50 μm）Fig.2 Effect of DHA on the nuclear morphology of SGC-7901（200×，bar=50 μm）

2.3 双氢青蒿素对SGC-7901细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验结果显示，与空白组相比，各剂量组穿过基质胶的数量明显减少。相较于空白组88.6%的细胞侵袭率，低剂量组的细胞侵袭率为66.8%，中剂量为54.3%，高剂量仅为11.4%。可见给药浓度越高，SGC-7901细胞侵袭率越低。见图3、4。

图3 双氢青蒿素对SGC-7901细胞侵袭能力的影响（400×）Fig.3 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability of SGC-7901 cells（400×）

图4 双氢青蒿素对SGC-7901细胞侵袭能力的影响Fig.4 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability ofSGC-7901 cells

2.4 DHA 对SGC-7901 细胞Bcl-2、Bax 和cleaved caspase-3蛋白表达的影响

Western blot 法检测结果显示，与空白对照组相比，随着DHA 浓度的增加，Bax 和cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，Bcl-2 和VEGF 蛋白表达显著降低（P<0.05），见图5。

图5 DHA对SGC-7901细胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF 蛋白表达的影响Fig.5 Effect of DHA on the expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3，and VEGF proteins in SGC-7901 cells

2.5 DHA对SGC-7901细胞凋亡的影响

使用流式细胞术对不同给药组进行检测，结果发现，不同给药组细胞均有不同程度的凋亡，且凋亡率与给药浓度成正比，即药物浓度越高，凋亡率越高。见图6。

图6 DHA对SGC-7901细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of DHA on apoptosis of SGC-7901 cells

3 讨论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一[4]。国家癌症中心数据显示，我国胃癌病例约占所有癌症病例的9.8%，位居第3；死亡病例约占所有癌症死亡病例的12.0%，同样位居第3[5]。如未能早期发现和治疗，很难通过手术、化疗和放疗等方法治愈。肿瘤细胞的侵袭和转移是影响癌症治疗的最主要原因之一[6]。因此，抑制转移过程是胃癌治疗的新策略[7]。DHA是青蒿素在人体内的活性代谢产物之一[8]，虽已有研究表明，DHA 可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，但是DHA 能否诱导胃癌细胞凋亡，并通过抑制胃癌侵袭和转移发挥抗肿瘤作用尚不完全明确。本研究将不同剂量的DHA 作用于胃癌SGC-7901 细胞，观察其对SGC-7901 细胞凋亡和侵袭能力的影响。CCK-8检测结果显示，DHA 作用SGC-7901 细胞24 h 后，细胞生长受到明显抑制，且随着DHA浓度增加，抑制作用明显增强。采用Hoechst 染色法观察细胞核的形态改变，激光共聚焦显微镜扫描结果显示，给药组的SGC-7901 细胞出现明显的细胞核固缩和致密浓染的形态变化，且有细胞核形态改变的细胞数量，与给药浓度呈正比。应用Transwell 染色法观察SGC-7901 细胞侵袭能力的改变，通过拍摄图片和计数后发现，空白组穿透基质膜的细胞数量明显增多，即给药浓度越高，穿透基质膜的SGC-7901 细胞数量越少，可见DHA 对SGC-7901 细胞的侵袭能力有影响。为求证DHA 能够抑制抑制SGC-7901 细胞的侵袭能力，选择VEGF 蛋白进行Western blot 检测。VEGF 是通过血管上皮受体VEGFR 介导的受体信号通路，是HIF-1α 的上调能够诱导VEGF 基因表达和血管生成，进而促进肿瘤细胞的生长和转移，是肿瘤细胞能够转移和侵袭的基础[9]。所以，抑制VEGF 信号通路可以有效抑制肿瘤的发生和发展。本实验结果表明，DHA 能够抑制VEGF 的表达，且给药浓度越高，VEGF 蛋白的表达量越低，可见DHA 能够抑制SGC-7901细胞的侵袭能力。细胞中的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白间的相互平衡介导细胞凋亡[10]，其中Bcl-2 和Bax 是研究较广泛的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，二者通常在正常的细胞中以二聚体的形式存在，可有效调控细胞的凋亡，且二者的比值介导细胞进入凋亡阶段的进程[11]。Bcl-2 表达增加后可结合Bax 形成异源二聚体，通过抑制Bax的活性并抑制细胞凋亡；Bax表达增加时可结合Bax 形成同源二聚体，通过活化caspase-9 酶切caspase-3 酶原，且激活caspase-3 表达对该剪切有促进作用，进而启动caspase级联反应，最终诱导细胞发生凋亡[12]。Western blot 检测结果显示，与空白组相比，DHA 各浓度组Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表达显著上升，Bcl-2 蛋白表达显著降低；流式细胞仪结果显示，各给药组SGC-7901 细胞凋亡数量较空白组明显增加，且随着给药浓度的上升，细胞的凋亡率也明显呈上升趋势。可见，DHA 对SGC-7901细胞有明显的促进凋亡的作用。

综上所述，DHA 能够抑制SGC-7901 细胞的增殖，诱导其凋亡，并能减弱SGC-7901 细胞的侵袭能力，表明DHA 对SGC-7901 细胞具有毒性效应，其机制可能与DHA 对Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和VEGF 蛋白表达调控有关，但具体的作用途径与机制还有待进一步研究。