黄芪活性成分结合EphA2的分子对接分析

韩 雪，金家莉，周蜜儿，武体林，万子豪，李志强，卞冰芝 （1.蚌埠医学院：a.检验医学院免疫学教研室；b.感染与免疫安徽省重点实验室；c.慢性疾病免疫学基础与临床安徽省重点实验室；d.检验医学院；e.临床医学院，安徽 蚌埠 33030；.安徽医科大学附属六安医院重症医学科，安徽 六安 37005）

在药物研发领域，寻找有效的药物分子并将其与目标蛋白结合是一个极具挑战性的任务。分子对接技术是一种常用的计算机辅助药物设计方法[1-3]，它可以预测分子之间的相互作用，为药物研发提供有力支持。黄芪作为中药材，具有广泛的药理活性，其主要活性成分黄芪总苷、黄芪总黄酮和黄芪总糖等化合物已被证明具有多种生物活性，具有很高的应用前景[4]。本研究旨在通过分析黄芪主要活性成分与目标蛋白EphA2 的结合模式，探讨药物分子与目标蛋白之间相互作用的机制，为药物研发提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 分子准备

黄芪主要活性成分一般为三大类，分别为黄芪总糖、黄芪总苷和黄芪总黄酮。黄芪总糖主要成分为葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖、葡糖醛酸和半乳糖醛酸等，这些单体主要通过α-型糖苷键进行连接，β-型糖苷键较少。黄芪总苷主要成分为黄芪皂苷甲，是一种羊毛酯醇形的四环三萜皂苷。黄芪总黄酮主要成分为黄芪苷和毛蕊异黄酮苷，两者的含量在黄芪总黄酮中较高，可达到30%~40%左右。此外，黄芪总黄酮中还含有其他黄酮苷类化合物，如木犀草苷、异黄酮苷、甘草苷等，它们的含量也可能在5%~20%之间。本实验选取了阿拉伯糖、黄芪皂苷甲和毛蕊异黄酮苷作为黄芪的主要活性成分进行后续研究。

1.2 蛋白质准备

从PDB 数据库获得蛋白结构[5]，在gHgL 蛋白与EphA2 蛋白结合的结构7CZF 中提取出EphA2 蛋白结构用于分子对接。再使用pymol和autodocktools软件处理蛋白质分子。从两个相同的蛋白质单体EphA2 结合形成的二聚体分子中提取出一条EphA2蛋白，移除结构中的所有水分子，并对蛋白进行加氢处理。

1.3 分子对接方法

使用Autodock4 和Autodock vina 两种不同的分子对接方法，Autodock4（版本号4.2.6，美国）和Autodock vina（版本号1.2.3，美国）软件均为蚌埠医学院购买。在对接过程中将搜索参数设置为60 Å×60 Å×60 Å 的网格框，中心位于蛋白的活性位点。网格间距设置为0.375 Å，这是Autodock4 中的默认值。关于蛋白的活性位点，实验分析了gHgL 与EphA2 蛋白的结合结构，重点关注两者结合的区域，确定参与结合的重要的EphA2 蛋白位点部分。此外，还允许蛋白侧链的灵活性参与对接过程，这是准确预测小分子结合的重要特征。

2 结果

2.1 分子对接结果

2.1.1 EphA2与阿拉伯糖对接结果

图1所示是使用Autodock4对接得到的最稳定的结构，结合能为-4.02 kcal/mol。对接的主要位点为阿拉伯糖的羟基与EphA2 蛋白的残基SER74、VAL72、MET73、GLN77、LYS50，一共形成了6 条氢键。结合中起主要贡献的是范德华作用、氢键以及脱溶能，三者一共贡献了-4.81 kcal/mol 的能量，静电能的贡献较小，仅为-0.04 kcal/mol。图2所示是使用Autodock vina进行对接得到的最稳定的结构，结合能为-3.71 kcal/mol。阿拉伯糖一共与EphA2 形成了1条氢键，为阿拉伯糖的羟基氧与氨基酸的氢原子成键。表1 所示的是使用Autodock4 对接得到的10 个构象及其结合能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的主要残基是SER74、ASP76、ASP78、GLY51、ASN71、ASP53、ASN71、THR45、VAL102 等。表2 是使用Autodock vina 进行对接得到的10个构象及其及核能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的残基有GLN77、GLU117、VAL102、ASN164、THR45、TYR67、ASP53、ARG82、ASP129、ASN60、ASP61、LEU128、ARG168、PHE134 等。综合两种对接方法，阿拉伯糖与EphA2 结合的残基主要有GLN77、VAL102、THR45、TYR67、ASP53、ASN164。

表1 使用Autodock4对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.1 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表2 使用Autodock vina 对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.2 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock vina docking method

图1 EphA2与阿拉伯糖Autodock4对接结果Fig.1 Docking results of EphA2 and arabinose by Autodock4

图2 EphA2与阿拉伯糖Autodock vina对接结果Fig.2 Docking results of EphA2 and arabinose by Autodock vina

2.1.2 EphA2与黄芪皂苷甲对接结果

图3所示是使用Autodock4对接得到的最稳定的结构，结合能为-5.06 kcal/mol。对接的主要位点为黄芪皂苷甲羟基与EphA2 蛋白的残基ASP53、ASN71、VAL72、MET73、ARG103，一共形成了7 条氢键。结合中起主要贡献的是范德华作用、氢键以及脱溶能。图4 所示是使用Autodock vina 进行对接得到的最稳定的结构，结合能为-3.85 kcal/mol。黄芪皂苷甲一共与EphA2形成了1条氢键，为黄芪皂苷甲的羟基氧与氨基酸的氢原子成键。表3 所示的是使用Autodock4对接得到的10个构象及其结合能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的主要残基是ASP53、ASN71、ARG103、MET73、VAL72、LYS162、THR101等。表4是使用Autodock vina进行对接得到的10 个构象及其及核能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的主要残基有ARG137、GLY49、ASP76、LYS50、THR45、GLN56等。综合两种对接方法，阿拉伯糖与EphA2 结合的残基主要有ASN71、ARG103、THR101。

表3 使用Autodock4 对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.3 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表4 使用Autodock vina 对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.4 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock vina docking method

图3 EphA2与黄芪皂苷甲Autodock4对接结果Fig.3 Docking results of EphA2 and Astragalus saponin A Autodock4

图4 EphA2与黄芪皂苷甲Autodock vina对接结果Fig.4 Docking results of EphA2 and Astragalus saponin A Autodock vina

2.1.3 EphA2与毛蕊异黄酮苷对接结果

图5所示是使用Autodock4对接得到的最稳定的结构，结合能为-5.87 kcal/mol。对接的主要位点为毛蕊异黄酮苷羟基与EphA2 蛋白的残基LYS50、ARG103、MET73、GLN77、VAL72，一共形成了5 条氢键，结合中起主要贡献的是范德华作用、氢键以及脱溶能。图6 所示是使用Autodock vina 进行对接得到的最稳定的结构，结合能为-4.16 kcal/mol，毛蕊异黄酮苷一共与EphA2形成了3条氢键，为毛蕊异黄酮苷的羟基氧与氨基酸的氢原子成键。表5 所示的是使用Autodock4对接得到的10个构象及其结合能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的主要残基是LYS50、ARG103、MET73、GLN77、VAL72、VAL102、LYS162、SER68、ASN106 等。表6 是使用Autodock vina 进行对接得到的10 个构象及其及核能、氢键数目以及氢键连接的残基，涉及的残基有CYS70、ASN71、GLY51、PHE134、ASN106、TYR48、GLY49、SER169、VAL165、ARG103、PHE108 等。 综合两个对接方法，阿拉伯糖与EphA2 结合的残基主要有ARG103、ASN106。

表5 使用Autodock4 对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.5 All conformational binding energies and bound residues obtained using the Autodock4 docking method

表6 使用Autodock vina 对接方法所得的所有构象结合能以及结合的残基Tab.6 All conformational binding energies and binding residues obtained using the Autodock vina docking method

图5 EphA2与毛蕊异黄酮苷Autodock4对接结果Fig.5 Docking results of EphA2 and mullein isoflavonoe glycosides by Autodock4

图6 EphA2与毛蕊异黄酮苷Autodock vina对接结果Fig.6 Docking results of EphA2 and mullein isoflavonoe glycosides by Autodock vina

2.2 gL与EphA2结合模式分析

据相关文献报道，gHgL 通过结合EphA2 的不同位点而介导KSHV、EBV 等γ-疱疹病毒感染宿主细胞[5-7]。因此，本研究进一步分析gHgL 与EphA2 的结合模式。从PDB 数据库下载gHgL 与EphA2 蛋白结合的结构，去除水分子、加氢之后载入chimera 软件。分析显示与EphA2 结合的主要是gL 蛋白，再使用氢键工具分析gL蛋白链与EphA2蛋白链之间的相互作用，得到表7，其中A 链为EphA2 链，C 链为gL 链。从表7 可以看出，gL 链与EphA2 蛋白链之间存在多个氢键作用，其中包括D..A 距离和D-H..A 距离两个参数。D..A 距离表示给体原子（Donor atom）与受体原子（Acceptor atom）之间的距离，D-H..A 距离表示给体原子上的氢原子与受体原子之间的距离。在这些氢键中，一些给体原子是来自gL 蛋白链上的酰胺氮或羟基氧原子，而一些受体原子则是来自EphA2 蛋白链上的羰基碳或羟基氧原子。这些给体和受体原子之间形成了稳定的氢键作用，促进了gL 链与EphA2蛋白链之间的结合。

3 讨论

黄芪总苷、黄芪总黄酮和黄芪总糖等化合物是黄芪的主要活性成分，它们通过不同的方式与目标蛋白结合，发挥着不同的生物活性。本研究主要探讨黄芪主要活性成分阿拉伯糖、黄芪皂苷甲和毛蕊异黄酮苷与目标蛋白EphA2的结合模式，并通过分子对接技术对其进行预测和验证。分子对接是一种计算机辅助的药物设计方法，它可以预测小分子与目标蛋白之间的相互作用，并为药物研发提供有力支持。Autodock4 是一种广泛使用的分子对接软件[8-9]，它基于Lamarckian 遗传算法和能量评估函数来进行分子对接[10]。这种方法可以考虑分子的柔性和蛋白质的柔性，适用于大规模的分子对接研究。其优点在于能够处理大量的分子和复杂的蛋白质结构，具有很高的准确性和稳定性。Autodock vina是一种基于梯度优化算法的分子对接软件[11-12]，它可以快速地预测分子之间的相互作用。相对于Autodock4，Autodock vina 的优势在于速度更快、准确性更高。Autodock vina可以搜索更大的对接空间，同时也考虑了分子的柔性，因此适用于大规模的分子对接研究。在进行分子对接研究时，可以根据实际需求和研究对象的不同，选择适合的分子对接方法，以获得更加准确可靠的结果。本研究同时使用Autodock4 和Autodock vina这两种不同分子对接方法，能够更全面地探索分子间的相互作用，提高分子对接的准确性和可靠性。

本研究使用Autodock4 和Autodock vina 最终得到了多个结合构象。通过分析不同构象的结合能、氢键数目以及氢键连接的残基，对黄芪主要活性成分与EphA2 蛋白的结合进行了研究。同时我们也分析了gHgL 与EphA2 蛋白的结合模式，确定了参与结合的重要的EphA2 蛋白位点部分。通过比较黄芪主要活性成分与gHgL 蛋白对EphA2 的结合模式，发现它们都是通过形成多个氢键作用来实现与目标蛋白的结合。在药物设计中，氢键作用通常是一种重要的相互作用方式，是一个需要深入研究的领域。通过分析氢键的距离和角度等参数进一步优化药物结构，可以增强其与目标蛋白结合的亲和力和特异性[13-14]。

综上所述，本研究为黄芪主要活性成分对gHgL与EphA2 蛋白结合的干预提供了一定程度上的解释，为靶向EphA2蛋白的干预药物设计提供了有价值的参考，并为进一步优化黄芪主要活性成分的结构、增强其与目标蛋白结合的亲和力和特异性提供了重要的参考。