纳米药物在缺血性脑卒中靶向治疗中的研究进展

张敏娜，唐仁明，袁丽丽，钟鸣，王光辉，5

（1.济宁医学院药学院，山东 日照 276826；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266500；3.济宁医学院基础医学院，山东 济宁 272067；4.济宁医学院司法鉴定中心，山东 济宁 272013；5.日照市老年大学，山东 日照 276826）

近年来，随着社会人口老龄化的加剧，缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）呈现高发势态，已位居心血管疾病致死原因的首位，也是致残的最主要原因［1-3］。IS 主要是由于脑动脉粥样硬化引起，粥样斑块导致血管弹性和顺应性下降，硬化斑块及血栓阻塞血管，脑组织的血液供应中断，葡萄糖等营养物质和氧供应减少导致脑组织受损［4-6］。传统的治疗策略，包括溶栓治疗、抗血小板治疗、血管内血栓切除术和抗炎治疗等，由于临床治疗时间窗狭窄（4.5 h），治疗效果欠佳。近年来，随着纳米技术在医学领域的广泛应用，高载药量、特殊核壳结构、良好的组织相容性和高渗透性的纳米药物不断问世［7-9］，有望破解IS 治疗困局。纳米药物可透过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），借助良好的靶向功能，进入梗死灶周围缺血半暗带脑组织发挥治疗作用，在脑血管疾病治疗中备受瞩目［10-11］。纳米药物可精准靶向缺血半暗带脑组织，借助高浓度活性氧（reactive oxygen species，ROS）微环境和低pH 值微环境刺激产生响应，释放药物，实现了治疗药物的可控性释放和靶向治疗。本文综述了纳米药物通过增加BBB 渗透、抗炎、抗血栓、清除活性氧物质、消除氧化应激损伤、调控单核巨噬细胞系统细胞表型、促进神经干细胞（neural stem cells，NSC）增殖分化和实现IS 治疗过程的追踪监测等方面研究成果，为进一步探索应用纳米技术对IS 靶向治疗开辟新思路。

1 血脑屏障、纳米药物结构功能和透过机制

BBB 是一种动态和功能性神经血管单元，可迅速调整脑血流以匹配大脑活动的新陈代谢需要；可将神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等与其供血的血管系统分开。纳米药物由纳米载体和药物组成，纳米载体以不同的形式与药物分子结合，包括化学键结合、物理吸附、包裹等，携带药物进入血液循环，最终经过BBB 进入脑组织，释放治疗药物。纳米载体能否顺利穿越BBB 是中枢神经系统疾病治疗成功的关键［12-14］。

1.1 血脑屏障的结构和功能

BBB 是脑组织和周围血液循环之间的生理屏障，由毛细血管内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接及内皮细胞基膜被星形胶质细胞足板包绕构成。BBB 正常生理功能包括主动转运葡萄糖和氨基酸等营养物质，满足脑组织的营养和代谢需求，通过调节血液和脑组织之间的物质交换，维护中枢神经系统正常功能。BBB 还参与抵御病原微生物、毒物和药物等对中枢神经系统的渗透［15-16］。

1.2 纳米药物结构和功能特点

BBB 阻碍药物输送或靶向输送，是针对中枢神经系统疾病的纳米药物首先要解决的问题，纳米药物的生物多功能和高生物相容性为穿越BBB、转运和有效治疗开辟了新的途径［17-18］。纳米药物是通过纳米化技术加工形成的纳米粒和纳米载体与药物的功能体。纳米级粒径和表面结构是纳米药物的优势。纳米药物粒径≤100 nm，与生物大分子蛋白和细胞外囊泡等生物活性物质的粒径相当，静脉给药可经过血液循环进入毛细血管，还可透过内皮细胞间隙，穿过机体的各类生物屏障进入病灶，可被细胞以胞饮的方式吸收。另外，纳米粒子表面原子化合价通常未达到饱和，会在其表面形成悬空键，存在极易成键的电子，从而使纳米粒子有很高的表面活性，可构成两亲性共聚物，若借此包埋疏水性药物，可明显提高其溶解度［19-21］，同时减少常规药物助溶剂的使用，减少助溶剂带来的不良反应。纳米药物载体经靶向基团修饰后可更高效靶向病灶区域（如肿瘤病灶），有针对性地释放化疗药物。与常规药物相比，这种给药方式可明显减少药物使用剂量，增强疗效的同时降低其不良反应，保护正常组织，如叶酸修饰载纳米粒、磁性载纳米粒、抗C5a 适配体纳米颗粒等［22-25］。纳米药物还可感应周围环境变化并作出结构改变释放药物成分，在低pH 等病灶特殊微环境下，实现响应性和可控性释放，进一步增强了药物治疗的靶向性［26-28］。

1.3 纳米药物通过血脑屏障的机制与作用

用于靶向脑组织递送的纳米材料可分为天然高分子、合成高分子、无机材料和磷脂等，构成脂质体、胶束、聚合物纳米颗粒、纳米凝胶、无机纳米材料和工程化细胞仿生纳米载体等，对脑组织呈现良好的选择性和靶向性［29-30］。纳米药物穿越BBB 机制主要包括：①借助纳米载体表面高亲和力配体，增强内皮细胞受体介导的胞吞作用；②正电荷的功能化纳米载体与带负电荷内皮细胞产生静电吸附，增强细胞胞吞作用；③纳米药物以其高度组织相容性理化性质，提高生物膜被动扩散功能；④抑制毛细血管内皮细胞药物外排泵P-糖蛋白逆向转运功能，减少药物外排；⑤调控毛细血管内皮细胞之间的紧密连接蛋白复合物，增加对药物的通透性；⑥诱导血管内皮细胞跨膜蛋白表达增加，增强药物转运。借助以上作用机制，纳米药物可穿越BBB，靶向缺血半暗带脑组织，抑制炎症反应，消除ROS，调控NSC 的增殖分化，提高神经元分化率，增加神经元的数量，诱导血管发生，为损伤脑组织修复创造良好的微环境，有望突破IS 治疗困局，为脑血管疾病的治疗带来新的希望（图1）。

图1 纳米药物透过血脑屏障抑制炎症反应、消除活性氧调控神经干细胞分化.ROS：活性氧；Ym1：几丁质酶3样蛋白3；Arg1：精氨酸酶1；COX2：环氧合酶2；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-1β：白细胞介素1β.

2 纳米药物在缺血性脑卒中靶向治疗中的应用

IS 永久性缺血性损伤过程主要包括ATP 匮乏导致细胞膜泵功能障碍，神经元和神经胶质细胞受损。另外，更严重的损伤发生在溶栓治疗后，血流再通导致缺血再灌注（schemia/reperfusion，I/R）损伤，大量分子氧随血液进入缺血组织，黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸，同时产生大量氧自由基为主的高浓度ROS 物质。ROS 趋化和激活炎症细胞，发生呼吸爆发（氧爆发），进一步产生大量氧自由基，发生严重的炎症反应和氧化应激损伤，造成神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞损伤，形成恶性循环。纳米药物对IS 过程中持续性缺血损伤重在溶栓、抗炎，增加血液供应，保护神经细胞，而I/R 损伤治疗，重在消除血液再通后发生的氧化应激、呼吸爆发导致的严重的炎症损伤，进一步保护神经细胞和血管内皮细胞。

借助纳米载体独特透过BBB 的机制是治疗IS的前提，尤其是I/R 损伤治疗过程，纳米药物提高药物的生物利用度，改善药动学和药效学的前提就是对BBB 的选择性突破携带药物的纳米载体进入脑梗死灶周围的缺血半暗带，在ROS、低PH值的炎症因子等微环境刺激因子作用下，释放溶栓剂、抗氧化剂、治疗基因等，保护神经元和促进神经组织再生。纳米药物治疗IS 作用机制及治疗作用主要包括：①抑制血栓形成，增强纤溶酶原激活剂溶栓效果；②促进抗炎性M2型小胶质细胞和单核-巨噬细胞极化，表达更多的炎症抑制因子，对抗炎症反应介导的脑组织损伤，同时抑制白细胞、星形胶质细胞等介导的炎症反应；③清除IS 和I/R损伤产生的ROS，削弱氧化应激性损伤；④将治疗基因导入NSC，编码调控NSC 向神经元方向分化，形成神经元信息传导网络，诱导损伤脑组织血管的发生参与组织修复（表1）。

2.1 抗血栓纳米药物

组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）和重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）因造成脑出血和神经毒性等严重不良反应，严重限制其在IS 治疗中的应用。急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）治疗策略包括t-PA或rt-PA溶解新形成的血栓、血管内血栓切除术或两者联合应用。纤维蛋白是血栓主要成分，是t-PA 或rt-PA 的靶标，但易导致严重脑出血，危及生命，降低剂量则难以达到满意的疗效。研究者将t-PA与盘曲状聚合物纳米结构（discoidal polymeric nanoconstructs，DPN）以共价键结合到含多孔基质的纳米载体上制备tPA-DPN 纳米药物，多孔结构使其可负载各种药物，达到快速溶栓的目的。DPN 多孔基质保护t-PA 免受循环血液中血清酶降解。大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）实验发现，tPA-DPN 纳米药物与血清酶接触3 h后仍保持70%以上活性；缩短溶栓时间，给药60 min 血栓减少（57.6±8.2）%（游离t-PA 组血栓减少（29.5±7.5）%；静脉注射2.5 mg·kg-1可溶解91.5%血栓（游离t-PA 组溶解40.8%血栓），治疗过程未见出血［31］。将rt-PA 与纤维蛋白亲和肽共同固定到聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）磁性纳米粒子（PLGA magnetic nanoparticles，PMNP）上，制备pPMNP-rtPA。应用流动系统压力依赖性血栓体外模型研究显示，pPMNP-rtPA 可将溶栓时间缩短40%；急性大鼠MCAO 模型溶栓实验显示，pPMNP-rtPA 负荷20%游离rt-PA 剂量即可恢复栓塞血管正常流量［32］。另外，用超声敏感纳米胶囊（nanocapsules，Nc）系统包封rtPA（Nc-rtPA），不但可有效防止血清酶分解，且实现了体外控制超声波触发纳米胶囊rt-PA体内可控性递送和释放［33］。

基于细胞结构和功能的细胞仿生纳米药物保留了起源细胞生物学性质，可逃避内皮网状系统细胞的吞噬，展示低免疫原性，可延长血液循环半衰期，增强组织靶向性。IS 发生过程中，血小板的激活和聚集反应是血栓形成的关键，携带t-PA 的膜联蛋白V 结合到工程化血小板膜上制备的携带t-PA的膜连蛋白结合血小板仿生纳米药物（annexin platelet-tPA，APLT-PA）对血液高凝状态形成的血栓具有治疗作用，其机制是APLT-PA中磷脂酰丝氨酸与血小板膜联蛋白V 结合后，抑制血小板凝集反应，干扰血小板小梁的形成过程，联合t-PA 后可进一步溶解已经形成的血栓。在小鼠光化学诱导MCAO（photochemical induced MCAO，PIMCAO）模型中，APLT-PA 保持较高的溶栓活性，时间长达7 d，显著改善小鼠运动功能和感觉功能［34］。阿替普酶（alteplase）是高选择性纤维蛋白酶激活剂，通过反微乳液/交联方法制备岩藻依聚糖功能化水凝胶多糖纳米粒，装载阿替普酶可构成携带阿替普酶特异性结合位点的藻依聚糖功能化水凝胶多糖纳米粒（fucoidan-functionalized hydrogel polysac-charide submicroparticle aletplase specific point，FFHP-A-SP），其中岩藻依聚糖识别表达在血栓区域的活化血小板的P-选择素，具备高度的靶向性。小鼠PIMCAO 实验结果显示，FFHP-A-SP 溶栓效果优于游离态药物，用药后BBB 通透性改变减轻，梗死面积减少32.8%，而游离药物组梗死面积减少16.5%［35］。值得注意的是，纳米药物主要针对短期内形成的新鲜血栓的治疗效果好，针对陈旧性血栓治疗主要以抗血小板凝聚药物和调节血脂稳定粥样斑块为主，清除陈旧血栓的纳米药物目前研究较少，有待深入研究。

2.2 抗炎纳米药物

IS 发生涉及多种信号通道和信号蛋白分子的异常表达和（或）活性改变，尤其是发生在I/R 期间的严重炎症反应，可造成BBB 损伤、动脉血栓和粥样斑块形成，导致神经传导受损和神经元兴奋性毒性［36］。因此，抗炎治疗为控制IS 病情进展的关键。Wnt/β-连环蛋白信号通路由Wnt 胞外信号和β-连环蛋白核内信号共同构成，参与炎症因子合成，芦丁（rutin）可抑制此信号通路。芦丁与透明质酸经酯化反应形成缀合物，连接全肽SS-31 和CD44 分子配体构成的纳米制剂，提高了芦丁穿越BBB 的能力，脑内芦丁药物浓度为对照组的1.8 倍，抗炎效果显著。进一步研究显示，芦丁与细胞膜上的血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受体具有高亲和力，可直接激活ACE2/血管紧张素1-7（angiotensin 1-7，Ang1-7）信号，有效抑制炎症过程，促进局部血管的增生［37］。单核巨噬细胞（monocytes/macrophages，Mo/Mφ）系统（包括Mo/Mφ 和小胶质细胞）、损伤脑组织浸润的白细胞和星形胶质细胞均可合成炎症细胞因子，破坏BBB 完整性，致脑组织损伤。小鼠MCAO 实验显示，糖皮质激素可阻断NF-κB 信号通路，抑制炎症反应，明显改善脑功能障碍［38］。miRNA-29通过抑制重组人补体C1q 肿瘤坏死因子相关蛋白6 减弱白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）表达，减轻BBB 损伤、减少缺血半暗带脑组织白细胞浸润［39］。富勒烯醇纳米粒（polyhydroxylated fullerenes nanoparticles，PFNP）在I/R损伤期间对缺血半暗带脑组织BBB和神经元具有保护作用，其机制可能是通过抑制白细胞释放IL-6，减少基质金属蛋白酶9（matrix metalloprotein-9）表达实现［40］。以血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）为靶向的脂质纳米载体颗粒（liposome-loaded nanocarriers）识别结合VCAM 穿越BBB，提高缺血半暗带脑组织药物浓度。在MCAO 模型小鼠中，以VCAM 抗体为靶点的纳米载体药物（地塞米松和IL-10mRNA）传递水平约为对照组的2 倍，其分别负载抗炎药物地塞米松和编码抗炎细胞因子IL-10mRNA，脑梗死体积分别减少35%和73%，并显著降低小鼠死亡率［41］。

2.2.1 靶向单核巨噬细胞

在脑I/R 损伤期间，血管通透性增加，在炎症趋化因子的作用下，循环血液Mo/Mφ浸润到缺血半暗带脑组织，介导炎症损伤。Mo/Mφ 极化的调节和平衡被认为是治疗脑I/R 损伤的潜在治疗靶点。载有黄酮类物质光甘草定（glabridin，Gla）的纳米颗粒Gla-NP，可有效抑制M1 型Mφ 极化从而抑制炎症因子生成，增强Mo/Mφ 的M2 型Mφ 极化，表达更多炎症抑制因子，对抗炎症反应。脾血窦内含大量Mφ，发挥吞噬血液中杂质（细菌、病毒等）和衰老血细胞的作用，也是中枢神经系统炎症反应中Mφ 的重要来源。正电子发射断层扫描成像显示，Gla-NP在静脉注射后经脾时因被Mφ 吞噬而选择性积聚，MACO 大鼠尾静脉注射24 h后，共聚焦显微镜检测显示，聚集在脾的Gla-NP 可间接造成脑缺血半暗带内Mφ 聚集减少。Gla-NP 治疗可减轻M1 型Mφ介导的炎症损伤，保护缺血半暗带脑组织濒临死亡的神经元，有助于脑功能的改善［42］。

2.2.2 靶向小胶质细胞

血液单核细胞来源的小胶质细胞，对胚胎时期和出生后大脑发育具有广泛的影响，可调节胚胎脑血管发生、神经营养因子分泌、中枢系统免疫监视和神经系统的发生过程。小胶质细胞在建立脑神经元网络连和突触形成中起关键作用，通过多种方式调节脑神经元信息连接网络，在神经系统发育过程中可通过分泌神经营养因子和吞噬作用来调节神经干细胞。M1 型小胶质细胞通过炎症细胞因子分泌引发神经元死亡，是缺血后导致损伤面积扩大的主要细胞。小胶质细胞激活释放的炎症因子和趋化因子是炎症损伤的根源。小胶质细胞极化可通过特定标记物的免疫组织化学分析来评估。活化的小胶质细胞产生的有害炎症损伤因子包括环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β和IL-6。Shin 等［43］通过靶向小胶质细胞研究载有吡仑帕奈（benzonitrile）的PLGA 构建纳米颗粒Ben-PLGANP。7日龄新生大鼠PIMACO模型显示，鞘内注射Ben-PLGA-NP 后检测TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2及M2 型小胶质细胞极化标记物几丁质酶3 样蛋白3（chitinase-3-like protein 3，Ym1）和精氨酸酶1（arginase1，Arg1）表达情况。结果显示，IS 发生后TNF-α，IL-1β，COX2 和IL-6 mRNA 表达增加，与对照组相比，Ben-PLGA-NP 组炎症因子表达明显降低；Ym1 和Arg1 蛋白表达均显著升高，M2 型小胶质细胞极化增加。IS 过程激活Toll 样受体4（tolllike receptor4，TLR4），导致小胶质细胞的促炎性极化和继发性神经元损伤。敲除小胶质细胞TLR4 编码基因，大脑中动脉短暂性闭塞（transient middle cerebral occlusion，tMCAO）模型小鼠受损脑组织炎症改善明显。沉默TLR4基因的小干扰RNA 即siTLR4，与新型LNP 复合，借助二油酰基偶联短拟肽DoGo310 构成siTLR4-DoGo310-LNP，该纳米药物很容易被氧-葡萄糖剥夺（oxygen and glucose deprivation）小鼠小胶质细胞内化而敲除TLR4基因，使小胶质细胞极化为抗炎表型。tMCAO模型小鼠单次注射siTLR4-DoGo310-LNP，siRNA主要在病灶周围缺血半暗带脑组织小胶质细胞中积累，TLR4基因表达显著降低，逆转细胞因子表达模式，由致炎细胞因子为主转化成抗炎细胞因子为主，显著改善小鼠运动功能和感觉功能［44］。小胶质细胞特异性抗炎表型可削弱炎症损伤并促进脑组织再生。IS 损伤区域小胶质细胞的抗炎极化是不可控的，但经超声作用的血小板杂交小胶质细胞纳米体系（platelet hybrid microglia nanosystem）可特异性极化小胶质细胞为抗炎表型（M2 型），减少神经细胞凋亡，促进组织再生修复［45］。缺血组织碎片中的游离双链DNA片段被小胶质细胞吞噬后，环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合成酶GMP-AMP活化，导致干扰素基因先天免疫刺激因子（stimulator of interferon genes）通路的强烈激活，引发炎症级联反应。两亲性共聚物、C-176 和Ce4+自组装形成的纳米粒子，可调节小胶质细胞炎症信号通路，改善IS预后［46］。

2.2.3 靶向星形胶质细胞

星形胶质细胞在IS 发生发展过程参与炎症反应，加重脑组织损伤。在众多DNA 纳米材料中，具有特殊空间构象的DNA 四面体（tetrahedral framework nucleic acid，tFNA）因能自由穿透细胞膜进入细胞而受到大量关注。tFNA 进入星形胶质细胞可抑制由OGD/复氧（OGD/reoxygenation，OGD/R）触发的钙过载和ROS 生成，减轻损伤；tFNA 促进星形胶质细胞从促炎表型向神经保护表型的极化。静脉给药后MCAO 模型大鼠脑梗死体积明显减小，促进中枢神经功能的恢复，其保护机制与tFNA 抑制TLR/NF-κB信号通路有关［47］。

2.3 清除ROS纳米药物

氧化应激是IS 脑组织损伤的主要机制，尤其是脑组织I/R 后，ROS 等产生加重了组织损伤。生理状态下，体内的过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶可消除生理剂量的ROS，维持内环境的稳态。IS 过程中，大量ROS 导致氧化应激性损伤。针对ROS 造成的氧化应激微环境，可用ROS 抑制剂依达拉奉、谷胱甘肽、正丁基苯酞和环孢素A 等，也可用天然抗氧化剂紫衫叶素、α 芒果苷、芝麻酚和银杏内酯B 等。但这些药物存在水溶性差、生物利用度低和代谢快的问题。将其制成纳米制剂后，药动学性质得以改善，有望发挥抗氧化的极大潜力。二氧化锰、二氧化锆、二氧化铈和铂等金属纳米粒表现出拟酶活性，模拟过氧化物酶和过氧化氢酶活性，因此称为纳米酶，纳米酶也可消除ROS物质，但考虑到金属粒子的毒性，金属纳米酶药物毒理作用和机制方面有待深入研究。采用天然生物材料构建仿生纳米药物不会引起免疫反应。应用在仿生纳米药物的天然生物材料主要有细胞膜、细胞外囊泡等，其可稳定存在于血液系统中，可穿透体内屏障结构，将携带的药物和核酸等递送至靶组织，从而达到治疗目的。

2.3.1 ROS抑制剂

在IS 发生期间及脑血管血液再通后I/R 损伤的情况下，形成的高浓度ROS会导致神经元和神经胶质细胞死亡，严重损害脑功能。依达拉奉（edaravone，EDV）为ROS 抑制剂，可改善神经症状，临床用于脑梗死急性发作治疗。药动学研究结果显示，EDV 纳米制剂静脉给药与依达拉奉溶液相比，血液循环时间延长3～4 h，在肾的分布减少了38.6%，生物利用度显著增加［48］。纳米凝胶被开发作为EDV 的药物载体，用谷胱甘肽（glutathione，GSH）作为靶向配体修饰纳米凝胶，可识别缺血损伤微环境中高浓度ROS，实现响应性释放EDV，对ROS进行有效抑制。纳米凝胶载体携带EDV 和GSH，使EDV-GSH-NG 具备强大的抗氧化功能。Wistar 大鼠MCAO模型给药后1周，治疗结果显示，氧化性代谢产物丙二醛和蛋白质羰基化合物浓度均降低；缺血半暗带脑组织损伤区域面积减少；大鼠空间记忆能力和学习能力及认知功能改善明显［49］。3-正丁基苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是我国科研人员自主研发的治疗IS 的药物，加载至环糊精衍生材料构建ROS 响应性纳米囊泡（nanovesicles，Nv），经缺血归巢肽（stroke-homing peptide，SHp）修饰后构成NBP-SHp-Nv，NBP-SHp-Nv 对缺血半暗带脑组织靶向性增强，借助转铁蛋白受体介导的胞吞作用，药物在BBB 血管内皮细胞中摄取显著增加，缺血脑组织中神经元树突和突触结构的重塑得到明显改善［50］。脑组织I/R 损伤过程中，神经元和小胶质细胞的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）过度开放，ROS 大量释放，引发神经元凋亡和脑组织炎症反应。免疫抑制剂环孢素A（cyclosporine A）可抑制mPTP 的过度开放，减少ROS 释放。纳米粒子CsA@HFn 可有效穿透BBB，选择性在缺血区域积聚，抑制BBB通透性增加，同时抑制神经元mPTP 过度开放，减少ROS 生成，抑制神经元凋亡［51］。有研究显示，ROS 响应性纳米药物穿越BBB 后，识别病灶（ROS 富集），ROS 改变其药物结构并释放药物，高效清除ROS，逆转IS 过程神经元铁死亡［52］。还原氧化还原纳米颗粒（reducedredoxnanoparticles，RRN）可有效清除自由基，有助于干细胞在损伤区域的存活。动物实验结果显示，RRN 的加入可显著提高移植牙髓干细细胞在IS动物（大鼠MACO动物模型）6 周存活率，存活率提高43.58%，RRD为牙髓干细胞移植后的成活和分化创造了良好的条件［53］。

2.3.2 天然抗氧化剂

天然抗氧化剂紫杉叶素（taxifolin）溶解性较差、穿透BBB 能力差，加大剂量易导致不良反应。基于硒纳米粒的硒-紫杉叶素纳米复合物（selenium-taxifolin nanocomplex），在体外暴露于外源性H2O2和体内缺血条件下，均可抑制神经元和星形胶质细胞中ROS 产生。其机制包括激活抗氧化酶消除ROS、抑制促炎蛋白表达、激活神经元保护基因和降低凋亡蛋白表达［54］。α 芒果苷（α-mangostin，α-M）是从山竹果皮中提取的天然抗氧化剂，具有减轻大鼠脑皮质神经元缺血性损伤作用，可维持神经元和神经胶质细胞中线粒体膜电位，抑制OGD/R诱导的线粒体特异性ROS产生。但α-M水溶性差，生物利用度低，阻碍生物学功能发挥及影响临床应用。为克服此缺点，Oka等［55］合成了基于环糊精的纳米颗粒（cyclodextrin-based nanoparticle，CDNP），其可提高α-M 装载率（与对照组相比提高78.5%）和结合常数。实验发现，MACO 大鼠静脉注射α-M/CDNP（25 mg·kg-1）后，大鼠脑梗死面积减少59.4%，神经行为明显改善。将天然抗氧化剂芝麻酚（sesamol）加载到纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）形成S-NLC（含芝麻酚80和100 μmol·L-1）。体外实验表明，给药1 h 后离体组织OGD 导致的细胞毒性明显降低，氧化应激性损伤减轻。大鼠静脉注射S-NLC（25 mg·kg-1）后，I/R损伤脑组织细胞损伤显著减轻，神经功能明显改善［56］。缺血区域过量ROS 以炎症反应和微血栓形成等级联效应导致脑组织损伤，Ye等［57］设计了加载银杏内酯B（ginkgolide B，GB）和MnO2的纳米递送系统（GB-MnO2-NDS），用于恢复IS的脑内微环境，其作用包括ROS清除、提高氧浓度和抑制血栓形成等。GB 可通过增强核因子E2 相关因子2 信号通路，激活细胞内源性抗氧化功能，从而保护脑组织免受氧化损伤。具有拟酶活性的MnO2可催化缺血微环境中高浓度的H2O2分解为O2，同时释放拮抗血小板聚集的GB 分子，缓解缺血半暗带脑组织缺氧损伤、氧化应激损伤，抑制血管内微血栓形成。

2.3.3 活性氧清除剂

过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等能够破坏ROS，但是分离纯化复杂、体外稳定性差，严重制约临床应用。研究发现，某些金属纳米粒表现出拟酶活性，如Fe3O4纳米粒子类似过氧化物酶，铂纳米粒子、二氧化锆粒子类似过氧化氢酶，二氧化铈（CeO2）纳米粒子类似超氧化物歧化酶。这些纳米粒子被称为纳米酶，其溶栓和ROS清除作用的结合，实现了对神经元的直接保护和对小胶质细胞和炎症因子的功能调节。CeO2纳米粒子具有强大自由基清除能力，负载NBP 构成NBP-CeO2-NP 用于IS 治疗，可消除OGD/R 小鼠脑微血管内皮细胞和海马神经元中的ROS，维持线粒体膜电位，减轻BBB 损伤，减少神经细胞凋亡。其在小鼠脑中动脉栓塞再通（middle cerebral artery embolization/recanalization，MCAO/R）模型中表现出出色的ROS 清除能力，保护线粒体功能，抑制神经细胞凋亡。长期神经行为结果显示，NBP-CeO2-NP 通过促进血管生成显著改善感觉功能和运动功能，提高动物空间学习能力［58］。另外，沸石咪唑盐骨架8 包封的CeO2纳米颗粒CeO2@ZIF-8NP，可延长血液循环时间、降低清除率、改善BBB 渗透能力、增强脑组织累积。研究发现，有效抑制MACO 模型小鼠缺血半暗带脑组织中ROS 介导的脂质过氧化过程对线粒体的损伤可抑制星形胶质细胞活化及炎症细胞因子的分泌［59］。绝大多数纳米酶都由金属离子构成，虽然展现出强大的酶催化活性，但金属离子对组织和器官的潜在毒性需要特别重视，进入体内的金属纳米粒子可导致不同程度的脏器损伤［60-62］。

2.4 多功能细胞仿生纳米药物

普通纳米材料普遍存在的问题包括制备过程繁琐和易被机体内免疫系统识别、清除等。生物膜仿生纳米药物通过机体内源性细胞膜对纳米载体表面进行包覆修饰，将天然生物膜性质和工程化功能载体融合，利用细胞膜表面蛋白质和多糖的功能使NP 避免被免疫系统攻击，并且赋予其疾病治疗靶向性，借助细胞膜表面蛋白和多糖作用，仿生纳米药物以游出的方式透过BBB 后，在损伤区域释放的细胞趋化因子的指引下，到达损伤部位。细胞仿生纳米药物集合多种生物学功能于一体，包括调控单核巨噬细胞系统细胞表型、抗炎功能、抗氧化应激等。与未进行细胞膜仿生修饰的NP 相比，修饰后的NP 体内循环时间延长6～8 h。基于细胞仿生技术的纳米药物M2 型小胶质细胞和巨噬细胞，可逃避免疫清除，靶向受损脑组织，调控小胶质细胞免疫表型。M2 型小胶质细胞细胞膜包裹过氧化氢酶（catalase，CAT）和自组装单宁酸（tannic acid，TA）的纳米颗粒TC@M2 NP，可按需释放TA 分子螯合损伤区域产生的过量Fe2+，减轻神经细胞因Fe2+过载导致的死亡；在酸性环境可响应性释放CAT，协同清除羟基自由基、超氧自由基和H2O2等多种ROS 产物。此外，M2 小胶质细胞不仅可作为仿生治疗剂将M1小胶质细胞极化为M2表型，还赋予纳米药物ROS清除功能和良好的缺血归巢能力，增强了治疗的靶向性［63］。多功能仿生纳米粒子（multifunctional bionic particle，MSAOR@Cur）由唾液酸（sialic acid）修饰当归多糖（angelica polysaccharides）表面，白藜芦醇（resveratrol，RES）以活性氧反应性草酸键为连接臂，构成内核包覆姜黄素（curcumin，Cur）的双亲性纳米粒子SAOR@Cur，最后使用工程化巨噬细胞膜伪装，将APS的神经保护作用、RES 的自由基清除功能和Cur 的抗炎作用进行有效整合。MACO 模型大鼠实验结果表明，MSAOR@Cur 可成功到达IRI 区域，明显减轻临床症状［64］。在炎症因子持续损伤和氧化应激作用下，虽然纳米酶有强大的抗炎和抗氧化应激特性，常规静脉给药治疗仍效果欠佳。为改善这一状况，有研究制备了工程化中性粒细胞膜包覆的介孔普鲁士蓝纳米酶MPBzyme@NCM，可有效改善纳米酶对受损脑组织的递送。Feng等［65］应用MPBzyme@NCM 治疗MACO 模型大鼠结果显示，缺血半暗带脑组织中抗炎作用的小胶质细胞，M2 型细胞明显增多，同时抑制趋化因子介导的中性粒细胞活化。

2.5 神经干细胞靶向纳米药物

在哺乳动物胚胎阶段，神经干细胞存在于神经管中，该神经管被称为中枢神经系统原基。NSC 是一种多潜能干细胞，具有显著的自我更新潜能，并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化和改善脑组织微环境的独特能力。NSC 合成和分泌多种生物活性细胞因子，包括①神经营养因子：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、睫状神经营养因子和神经营养因子3等；②促血管生成因子：成纤维细胞生长因子2 和血管内皮生长因子；③抗炎活性生物分子：IL-37、转化生长因子β1、前列腺素E2、肝细胞生长因子、一氧化氮和血氧化酶1 等。NSC 移植是一种很有前景的治疗模式，可诱导神经发生和血管发生、抑制脑组织炎症反应和提高其抗氧化应激的能力，为治疗各种神经系统疾病的合理有效的方法。NSC 通过分化形成神经元替代死亡神经元，通过NSC增殖分化和迁移，重新建立神经元信息网络，有望实现脑功能完全恢复。研究显示，成年哺乳动物脑室下区和齿状回中具有少量自我更新和多向分化潜能的NSC，脑损伤后有望诱导分化参与脑组织修复［66］。无论是内源性NSC 激活还是外源性NSC 移植，自然条件下神经元低分化率问题等制约着治疗效果，携带治疗基因的纳米药物有望解决这个问题。目前利用功能化纳米粒子的载体性能递送分泌型基质糖蛋白、miRNA 和siRNA 等，有望通过对NSC 的定向分化实现高效调控，增加神经元的形成，改善神经元的缺失，恢复神经元信息传导网络。

2.5.1 基因纳米药物

神经干细胞移植到大鼠MACO 模型进行治疗实验，早期治疗效果较好。早治疗可通过其产生的各类生长因子的旁分泌机制减少缺血区神经组织损伤。在体内，NSC 通常分化为星形胶质细胞，神经元分化不良对治疗结果产生不利影响。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）为NSC分化调控的关键基因片段，可抑制NSC向神经元方向分化［67］。反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASO）、siRNA、miRNA 等核酸分子可通过翻译或调控功能干预NSC分化过程。Lin等［68］研究发现，超顺磁性氧化铁纳米粒（superparamagnetic iron oxide particles,SPIOP）偶联siRNA/ASO，siRNA/ASO 通过沉默lncRNA 使NSC 向神经元方向分化。研究表明，siRNA/ASO 不仅通过沉默lncRNA 来引导NSC 的神经元分化，还显著改善急性IS 中缺血半暗带脑组织损伤，有助于脑功能的恢复。另外，上调NSC 中缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，IHF-1α）表达可改善IS 治疗中NSC 移植后的存活和迁移。可抑制内源性HIF-1α泛素化的功能性多肽，可有效上调NSC 中HIF-1α表达，提高治疗效果。将功能性肽和SPIOP 共同输送到NSC 中，不仅可促进NSC 存活和迁移能力，还可通过核磁共振成像对体内移植的NSC 进行动态追踪监测［68］。

损伤区域的NSC大多分化为星形经胶质细胞，参与组织填充形成瘢痕，不利于神经元信息网络的形成和传导功能的恢复。miR-124 可促进NSC 分化为成熟神经元，但其不稳定性和低生物相容性限制其临床应用。钙金属有机骨架材料（calcium metal organic frameworks，Ca-MOF）借助其结构组成多样、比表面积和孔隙率较大等优势，包封治疗药物后可增强治疗效果。钙金属纳米有机骨架包封miR-124 形成Ca-MOF@miR-124 可有效防止核酸酶降解miR-124，同时促进NSC 内化miR-24，发挥治疗作用。Wang 等［69］研究结果显示，MACO模型大鼠给予Ca-MOF@miR-124 第5 天检测到有电生理功能的成熟神经元，第7 天缺血区损伤接近完全恢复。分泌型基质外糖蛋白reelin 参与大脑发育、学习记忆、情绪调控等过程，转铁蛋白受体单克隆抗体（transferrin receptor monoclonal antibody）OX26-聚乙二醇化硒纳米粒OX26-PEG-Se-NP 可缓解缺血性脑卒中的脑水肿，维护海马神经元轴突和髓鞘完整性，其保护机制与代谢调节因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及信号通路有关，另外mTOR 参与DNA 转录和蛋白质合成，调控NSC增殖分化、生长、凋亡和自噬等过程，对缺血性脑卒中损伤后再生修复具有重要治疗意义［70］。

2.5.2 基质外糖蛋白纳米药物

IS 存在广泛的神经元丢失、胶质瘢痕形成和神经组织变性导致的神经元信息传导网络受损，神经功能功能障碍明显。NSC 与纳米生物材料的组合可加速新生脑组织的形成，参与损伤修复。分泌型基质外糖蛋白reelin 参与大脑发育、学习记忆和情绪调控等过程，在神经发育早期以及成熟后的大脑内环境的稳定中扮演重要角色。Reelin 和NSC 加载到聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇PLGA-PEG 纳米胶束，该系统具有强大的神经组织再生潜力。Amani 等［71］研究发现，PLGA-PEG-Reelin/NSC 实验组诱导NSC分化率明显提高，相差显微镜观察到NSC 分化细胞的神经突生长，轴突化和树突化明显。免疫荧光证实，分化细胞中神经元占65.56%，星形胶质细胞生成显著减少。另外检测到大量血管性血友病因子阳性细胞，即新生血管内皮细胞，进一步证实PLGA-PEG-Reelin/NSC 诱导缺血半暗带脑组织局部血管的发生。

3 纳米药物在lS诊疗和评估中的应用

基于纳米药物的纳米成像技术的应用显著提高了IS 诊疗和病情评估能力，在治疗监测方面颇具优势。IS预期治疗效果严格依赖于时间，4.5 h的治疗窗口较为狭窄，缩短诊断和治疗时间间隔可提高患者生存率。血小板纳米气泡（platelet nanobubbles，PNB）用于小鼠PIMCAO 模型，利用近红外荧光成像、多模式光学成像和全场激光多普勒血流灌注成像仪，研究PNB 的生物分布、缺血区微血管网络变化情况和脑血管内血流量。研究发现，PNB 具有精确的病灶靶向能力，可对损伤的微血管发挥生物重构作用，2 h 内实现血管再通，及时保护神经组织；缺血半暗带脑组织聚集PNB，可通过实时超声成像监测［72］。溶栓剂与荧光材料结合，可用于BBB早期损伤评估。蛋白质-碳点纳米杂化物通过共价键将碳点结合到溶栓剂，可实现对BBB 损伤和颅内出血的动态追踪［73］。半导体聚合物纳米颗粒通过980 nm 激光照射进行荧光成像，可高清晰度实时显示脑血管分布和血流状态［74］。纳米金探针（gold nanoparticle probes，GNP）可被小胶质细胞吞噬后内化，在MACO 模型小鼠中，GNP 静脉注射经核磁共振成像，在缺血损伤区呈现较暗的低信号影。进一步通过X 射线显微镜连续观察发现GNP 在缺血半暗带脑组织的累积随时间增加，证实小胶质细胞对GNP的吞噬随时间增加，实现了治疗的实时监测和动态追踪［75］。

4 结语

抗血栓纳米药物、抗炎纳米药物、清除ROS 纳米药物和促进NSC 参与脑组织修复纳米药物等可有效遏制IS 的发生发展，挽救缺血半暗带脑组织中濒临死亡神经元和神经胶质细胞。纳米药物治疗优势包括：①低免疫原性，减少免疫系统的识别和清除，延长体内血液循环时间，改善药动学特征；②减少正常组织对其摄取，降低组织毒性，增强BBB 渗透和靶向病变部位，提高药效；③多功能纳米载体集合不同靶标的治疗药物展开协同治疗，显著改善临床症状；④实现药物对病灶缺血微环境的响应性释放，包括对ROS 或pH 值、凝血酶、炎症因子等标志物等的反应；⑤实现基因对NSC 定向分化的有效调控，增加神经元分化，创造神经干细胞在缺血损伤微环境中增殖分化良好条件，有利于血管发生；⑥实现了治疗过程的动态实施监测和及时评估。目前缺血性脑卒中损伤微环境中存在的炎症信号通路的激活及神经组织可能存在的其他修复作用，如内源性神经干细胞的激活参与再生修复等，有待于深入研究纳米载体的代谢和消除机制、临床应用的长期安全性包括神经毒性等不良反应需要进行监测；药物毒性是制约临床转化的关键，纳米载体和纳米酶毒理学研究尚需在更高层次进行；BBB 仍然是大多数纳米药物需要挑战的生物屏障。纳米药物治疗脑血管疾病的新时代已经开启，相信随着纳米技术的进一步发展及纳米药物毒理学方面研究的深入，新型纳米制剂的问世将惠及更多IS患者。