线粒体示踪体系的建立及验证

吕琳，王思涵，3，曾泉，段晗，2，毛壮，王唱垚，2，裴雪涛，3，王华，李艳华，3

（1.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850；2.河北大学生命科学院，河北 保定 071000；3.华南生物医药研究院华南干细胞与再生医学研究中心，广东 广州 510005）

肿瘤放射治疗或突发核事故等都可对人体正常组织造成辐射损伤，不同剂量的电离辐射可对造血系统、胃肠系统和神经系统等造成不同程度的损伤。小肠是辐射损伤最敏感的器官之一［1］，高剂量的电离辐射可导致患者出现小肠缺血、黏膜炎症、溃疡、穿孔和坏死等，严重影响患者生存质量［2］。辐射暴露会加重细胞内自由基诱导的大分子物质氧化损伤，甚至引起细胞凋亡，这一结局可能与线粒体介导的凋亡通路密切相关［3］。此外，辐射暴露导致细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多会对生物组织造成损害，有研究表明，高ROS 水平会对线粒体功能产生不利影响［4］。辐射暴露也会导致细胞内线粒体功能障碍，阻碍细胞自我更新［5］。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类多潜能干细胞，具有强大的自我更新和多向分化能力。研究表明，MSC 具有促进损伤组织再生、调节炎症反应、减轻纤维化、降低ROS 水平、抑制上皮间质转化等功能［6］。近年研究发现，MSC 可通过细胞融合、与周围细胞形成隧道纳米管、紧密连接等方式向受损细胞递送细胞器，如线粒体，以增强受损细胞活力和增殖能力，减少细胞凋亡，促进组织损伤修复［7］。牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSC）是一种来源于牙髓组织的MSC，相比其他来源的MSC，如脐带来源MSC，DPSC在成骨分化、免疫调节、抗凋亡和抗衰老等方面具有显著优势［8］。

研究表明，MSC 在缓解辐射损伤方面具有巨大潜能［9］，而MSC 是否能够向辐射损伤组织细胞递送线粒体以达到一定的治疗效果，目前尚无明确报道。本研究构建了可用于示踪线粒体的质粒载体pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2，经293T 细胞包装获得慢病毒（Lv-COX8A-DsRed2），感染DPSC 并标记其线粒体；利用X 射线照射大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6 细胞，并在照射后补充稳定表达线粒体荧光报告系统的DPSC-COX8A-DsRed2，通过对线粒体的示踪，探讨DPSC能否向辐射损伤的IEC-6细胞递送线粒体，探索建立的线粒体示踪体系是否可标记线粒体运动轨迹，为后续线粒体转移的机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

大鼠小肠隐窝上皮细胞系IEC-6 和人胚肾细胞系293T由本实验室保存；DPSC由北京三有利和泽生物科技有限公司惠赠。

慢病毒载体（pSIN-SFFV）和辅助质粒（pMD2.G和psPAX2）由本实验室提供；感受态细胞DH5α，北京擎科生物科技有限公司；慢病毒感染增强液，上海吉凯基因化学技术有限公司；DMEM 培养基、α-MEM 培养基和Opti-MEM 培养基，美国Gibco 公司；胎牛血清，澳大利亚AusgeneX；脂质体转染试剂LipofectamineTM3000 和绿色荧光线粒体染色剂MitoTracker Green FM，美国Invitrogen 公司；流式抗体PE-CyTM7 Anti-Human CD90（货号：561558）、Hoechst33342（货号：561908）购自美国BD Bioscience 公司；线粒体膜受体线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20 gene，TOMM20）抗体（货号：ab186735）、驴抗鼠IgG（Alexa Fluor®488）（货号：ab150073）二抗购自英国Abcam公司；5（6）-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯（CFSE）（货号：21888），美国Sigma-Aldrich公司。

DL-CF-2ND I 超净工作台，哈尔滨东联公司；XMTD-6000 恒温水浴锅，北京长风公司；YDS-50B-125 液氮罐，Haier 公司；5810R 离心机，美国Eppendorf 公司；3111CO2恒温细胞培养箱，美国Thermo Fisher Scientific 公司；INNOVA42R 低温摇床，美国New Brunswick 公司；uastercycle PCR仪，美国Eppendorf 公司；GEL DOC XR+凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；ECLIPSE Ts2 倒置生物显微镜，X-Light V3 共聚焦荧光显微镜，日本Nikon公司；Guava easyCyteTM12HT Base System 流式细胞仪，美国Luminex公司。

1.2 细胞传代和培养

取对数生长期的DPSC，弃培养基，PBS 洗涤后，加入0.25%胰酶，37 ℃恒温箱孵育完全消化后加入新鲜的含有10%胎牛血清的α-MEM 培养基，中和胰酶消化液，收集细胞悬液，800×g22 ℃，离心5 min，弃上清，用α-MEM+10%FBS 完全培养基重悬细胞，按照1∶3比例传代培养。

取生长状态良好的IEC-6细胞，弃培养基，使用PBS 洗涤1～2 次，加入0.25%胰酶，37 ℃孵育待完全消化后加入完全培养基以中和消化液，收集细胞悬液，800×g22 ℃，离心5 min，弃上清，用高糖DMEM+10%FBS 完全培养基重悬细胞，按照1∶3比例进行传代培养。

1.3 pSlN-EF1α-COX8A-DsRed2质粒构建和鉴定

1.3.1 质粒载体构建

从GenBank 数据库获取EF1α，COX8A和DsRed2 基因序列，根据载体构建方案，由华大基因合成。COX8A基因编码线粒体电子呼吸链复合体Ⅳ中细胞色素c 氧化酶最小的亚单位，序列中含有靶向定位于线粒体的信号肽序列［10］。我们将慢病毒载体pSIN 中的原有启动子SFFV 经酶切去除后，通过同源重组的方式依次将EF1α、COX8A和DsRed2 基因序列插入，构建成慢病毒载体pSINEF1α-COX8A-DsRed2，并同步构建了阴性对照慢病毒载体pSIN-EF1α-DsRed2。取质粒50 ng转化至DH5α感受态细菌，LB固体培养基培养12～16 h，挑取单克隆，37 ℃摇床孵育过夜，提取质粒，将构建的质粒命名为pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2（COX8ADsRed2）。

1.3.2 质粒鉴定

根据插入的目的基因COX8A、DsRed2 设计上下游引物，正向引物5'- ACAGATCCAAGCTGTGAC-3'（位于COX8A序列前89bp 处）；反向引物5'-CCTCATAAAGAGACAGCAAC-3'（位于DsRed2序列后167 bp 处），通过PCR 扩增目的基因，PCR反应体系如下：12.5 μL Q5 High-Fidelity 2X Mix，1.25 μL 10 mmol·L-1正向引物，1.25 μL 10 mmol·L-1反向引物，100 ng DNA 样品，最终以无核酸酶水补齐至25 μL。

反应条件：98 ℃预变性30 s，98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共计30 个循环，最后72 ℃延伸2 min，10 ℃保持。随后取5 μL 反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4 慢病毒制备

将生长状态良好的293T细胞传代接种于10 cm细胞培养皿中，待细胞密度为50%～60%时，细胞换液，加新鲜的DMEM 无血清培养基10 mL。配制脂质体转染体系：Opti-MEM 培养基1 mL，COX8ADsRed2 质粒8 μg，psPAX2 质粒6 μg，pMD2.G 质粒2 μg，LipofectamineTM3000 20 μL，P3000 32 μL，混匀后静置15 min，随后将混合的转染液缓慢逐滴加入培养基中。12 h 后细胞换液，缓慢轻柔加入新鲜的DMEM完全培养基，48～72 h后收集病毒上清至离心管中，4 ℃，3000×g，离心20 min，0.45 μm滤膜过滤，去除细胞沉淀。4 ℃，120 000×g，离心90 min，弃上清，以100 μL 高糖基础培养基重悬，分装并贮存于-80 ℃。

1.5 慢病毒感染DPSC

取对数生长期的DPSC，细胞数目为6×105接种于6 孔板中，24 h 内生长密度达到60%～80%。取浓缩病毒液，用α-MEM 基础培养基稀释100 倍，缓慢滴加到培养皿中，同时加入慢病毒感染增强液每孔40 μL，置于CO2培养箱37 ℃孵育12 h后，更换新鲜的α-MEM 完全培养基，继续培养48～72 h 后，在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达情况，感染后的细胞称为DPSC-COX8A-DsRed2。

1.6 免疫荧光染色检测DPSC-COX8A-DsRed2 与线粒体膜受体TOMM20共定位

取生长状态良好DPSC-COX8A-DsRed2，细胞数为1×104接种于共聚焦小皿中，使用4%多聚甲醛室温孵育10 min，预冷的PBS 洗涤3 次，每次5 min；加入0.25% Triton-X-100 破膜，室温孵育15 min，预冷的PBS 洗涤3 次，每次5 min；加入10%驴血清（PBS 溶液配制）室温封闭1 h，吸弃封闭液，按照抗体试剂说明书加入一抗TOMM20抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；隔天取出小皿，恢复室温，PBS洗涤3次，每次5 min，加入驴抗鼠IgG 二抗（1∶2000），室温避光孵育1 h，PBS 洗涤3 次，每次5 min；加入DAPI 溶液（1∶500）室温避光孵育15 min，PBS 洗涤3 次，每次5 min，共聚焦荧光显微镜下观察DPSC-COX8A-DsRed2 的红色荧光是否与TOMM20的绿色荧光重合，并拍照记录。

1.7 活细胞染色检测DPSC-COX8A-DsRed2 与线粒体示踪试剂MitoTracker Green 共定位

取生长状态良好DPSC-COX8A-DsRed2，调整细胞数为1×104接种于共聚焦小皿中，将Mito-Tracker Green试剂用培养基稀释至300 nmol·L-1，37 ℃避光孵育25 min，37 ℃预热的PBS洗涤3次，每次5 min，共聚焦荧光显微镜下观察DPSCCOX8A-DsRed2 的红色荧光是否与MitoTracker Green的绿色荧光重合，并拍照记录。

1.8 细胞辐照和处理

取生长状态良好的IEC-6，细胞数目为1×104接种于共聚焦小皿中，使用10 Gy X 射线对细胞进行照射［11］，对其进行CFSE 荧光染色（CFSE 试剂浓度为5 μmol·L-1，标记时间10 min）以标记IEC-6细胞，随后加入细胞数每孔为2×103DPSC-COX8ADsRed2 进行共培养，24 h 后通过共聚焦荧光显微镜观察绿色荧光细胞内是否出现红色荧光以判断细胞间发生了线粒体转移。

1.9 流式细胞术检测lEC-6 细胞线粒体数目和线粒体转移率

取生长状态良好的IEC-6，细胞数目每孔为5×105接种于六孔板中，使用10 Gy X射线对细胞进行照射，随后加入细胞数为1×105DPSC-COX8ADsRed2进行共培养24 h。随后制成细胞悬液收集于流式管中，对其进行MitoTracker Green 标记，试剂浓度为500 nmol·L-1，37 ℃避光孵育25 min，400×g离心5 min；PBS 洗1 次，每管加入PE-CyTM7 Anti-Human CD90试剂5 μL，室温避光孵育15 min，400×g离心5 min；PBS 洗2 次，300×g离心5 min，500 μL PBS重悬，使用流式细胞仪检测细胞线粒体数目和线粒体转移率。

2 结果

2.1 构建pSlN-EF1α-COX8A-DsRed2 质粒并成功标记牙髓干细胞DPSC

PCR 结果显示（图1A），载体中插入COX8ADsRed2 基因大小约1500 bp（图1B），与预期大小相符。将质粒载体pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2送公司测序，结果显示插入基因为COX8A及DsRed2基因序列。制备慢病毒（Lv-COX8A-DsRed2）感染DPSC 荧光观测结果显示（图1C），DPSC 可以表达红色荧光蛋白，表明DPSC-COX8A-DsRed2 细胞构建成功。

Fig.1 Expression of the mitochondrial fluorescent reporting system in dental pulp stem cells（DPSC）.A：map of pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2；B：PCR amplification result of the plasmid；C：the intracellular expression of the red fluorescence protein in DPSC was observed under fluorescence microcopy.

2.2 DPSC-COX8A-DsRed2 表达的红色荧光蛋白准确定位于线粒体上

DPSC-COX8A-DsRed2 细胞进行线粒体膜受体TOMM20免疫荧光染色，结果可见长梭形细胞中出现红色荧光，同时可检测到TOMM20抗体染色呈现的绿色荧光，两者可重合为黄色荧光（图2A 白色箭头指示位置）。经流式分选后的DPSC-COX8ADsRed2 细胞用MitoTracker Green 进行荧光染色，可见细胞线粒体为绿色荧光区域与DPSCCOX8A-DsRed2 显示的红色荧光存在共定位，两者重合为黄色（图2B）。同时，阴性对照DPSCDsRed2 整个细胞都标记成红色，与MitoTracker Green指示的绿色荧光区域并不完全重合（图2C）。以上结果表明，构建的线粒体荧光报告系统与线粒体膜受体特征蛋白TOMM20 和MitoTracker Green 均存在共定位，COX8A-DsRed2 报告系统可作为一种线粒体荧光探针指示细胞内线粒体的分布。

Fig.2 Fluorescent reporter system accurately localizes to mitochondria.DPSC-COX8A-DsRed2 was stained by TOMM20 protein and MitoTracker Green to verify the red fluorescence was localized in the mitochondria.The localizations were also compared by the negative control DPSC-DsRed2 stained with MitoTracker Green.A：co-localization with TOMM20 protein；the white arrows indicated that the red fluorescence and the green fluorescence were merged；B：co-localization with MitoTracker Green ；C：co-localization between DPSC-DsRed2 and MitoTracker Green.

2.3 DPSC-COX8A-DsRed2 向辐射损伤lEC-6 细胞转移线粒体

辐射损伤共培养体系（图3A）的荧光成像显示，DPSC-COX8A-DsRed2 细胞携带的红色荧光的线粒体转移到了绿色荧光标记的IEC-6 细胞中（图3B），提示构建的线粒体荧光示踪系统可有效地指示DPSC线粒体的转移。

流式细胞术结果发现，与未辐射组IEC-6 细胞相比，辐射组IEC-6 能更多地获得来自DPSCCOX8A-DsRed2 的线粒体（图3C）。同时，辐射损伤会导致IEC-6 细胞内线粒体数目降低，DPSC 干预后，细胞内线粒体数目显著增多（图3D）。以上结果表明，DPSC能够向辐射损伤细胞转移线粒体，构建的线粒体示踪体系能够指示细胞间线粒体的转移。

3 讨论

MSC 可通过细胞与细胞间的线粒体交换补充受损细胞功能障碍的线粒体，这一过程称为MSC与靶细胞间的线粒体转移［12］。本研究构建了一个可定位于线粒体的荧光蛋白报告系统，实现了MSC内线粒体的可视化观察，为研究MSC与靶细胞间线粒体转移这一生物学现象提供必要的工具。

传统的线粒体示踪方法是通过使用线粒体示踪染料实现的，如四甲基玫瑰胺或罗丹明123，这类染料具有正电荷和适当的亲脂性等特点［13］，其标记线粒体的主要原理是基于线粒体内外膜的膜电位能够与适当正电荷的小分子荧光探针形成静电作用，使其具有靶向线粒体的特点。除了传统的阳离子染料作为典型的靶向线粒体探针之外，中性荧光团也可连接到一个带正电的探针上以获得靶向线粒体的能力，如经典的三苯基膦（TPP）［14］。而在受损线粒体示踪的应用中，这些探针可能存在缺陷，如在标记异常线粒体中，特别是依赖于线粒体膜电位的染料，一旦线粒体膜电位丧失就会被洗掉，而需要细胞进行醛类固定或者包含线粒体能量状态影响因子的实验中应用大受限制，同时游离于线粒体之外的荧光染料可能会成为荧光信号的干扰因素［15］。目前常用的线粒体染色剂MitoTracker，是一种可以进入活细胞标记线粒体的染料，包含轻度硫基化的氯甲基活性部分，可以与半胱氨酸残留物的游离硫醇基发生反应，从而与基质蛋白结合，用固定剂破坏膜电位后不会被洗掉，然而与传统的阳离子线粒体探针一样，MitoTracker受限于荧光因外环境淬灭，无法长时间实时示踪活细胞中的线粒体以动态观察线粒体转移的过程。近几年，融合酶标签和化学感受器表达的线粒体定位的报告载体成为新一代研究线粒体的工具。以该原理作为技术背景，Johnson 团队利用定制荧光底物基因与特定基因序列，如标签蛋白SNAP［16］，融合表达对指定亚细胞区进行荧光成像［15］。该技术中，荧光底物和标签融合蛋白将形成原位探针蛋白缀合物，从而实现了线粒体不受其微环境、细胞环境影响的荧光示踪［17］。

应用线粒体定位表达的报告载体可实现活细胞之间的线粒体转移的示踪。本研究通过将红色荧光蛋白（RFP）基因与可定位于线粒体的COX8A蛋白的基因进行融合表达，构建了可定位表达于线粒体的红色荧光报告系统。RFP 是从珊瑚（Discosomasp）中提取的一种与绿色荧光蛋白同源的一种生物发光蛋白［18］。Clontech 公司将其进行低毒、低寡聚化处理，形成突变体DsRed，具有对组织损伤小、光漂白作用低等优点，更适用于深层组织器官的活体成像。DsRed2是Clontech公司对DsRed进行连续定点突变的人工突变体，与DsRed 相比，其N端净电荷减少，寡聚化程度降低，在细胞内荧光效率高，更易检测［19］。本研究为了降低线粒体荧光报告系统对MSC 功能的影响，选择DsRed2作为荧光报告基因。细胞色素c 氧化酶COX 家族的蛋白具有线粒体定位信号，将其基因与荧光蛋白基因融合表达可帮助荧光蛋白定位于线粒体。COX8A 是线粒体电子呼吸链复合体Ⅳ中细胞色素c氧化酶最小的亚单位［10］，COX8A序列中包含了一段长约15～30 个氨基酸的前导肽序列，也是目前最常用的靶向线粒体的信号肽序列，可将荧光蛋白引导到细胞线粒体内膜上，实现线粒体的可视化［20］。本研究通过将电子呼吸链复合体Ⅳ中细胞色素c氧化酶最小的亚单位COX8A 与红色荧光蛋白DsRed2 进行融合表达，构建了线粒体红色荧光报告系统COX8ADsRed2。通过COX8A序列中的前导肽将该探针靶向定位到线粒体膜上，从而能够实时观察到细胞线粒体的分布及转移。通过与MitoTracker 对比实验证明，我们构建的线粒体报告系统可准确定位到细胞线粒体上，并且能够长时间稳定表达红色荧光，同时通过对其线粒体功能进行初步检测，发现插入序列对于线粒体的功能没有影响。不仅如此，细胞感染含该报告系统基因的病毒后经过冻存与复苏仍能保持红色荧光稳定表达于线粒体上，是实现线粒体实时可视化的理想工具。由于我们构建该工具细胞时选取的是原代MSC，病毒感染效率较低，红色荧光蛋白表达阳性细胞的比率约5%，后续用于示踪观察线粒体转移需要对该细胞进行分选纯化。此外，该细胞经多次传代可能出现细胞衰老现象，对衰老细胞线粒体转移相关功能验证可能存在限制。

我们课题组前期研究表明，大剂量X 射线照射可以导致肠隐窝细胞系IEC-6 细胞凋亡［11］，其线粒体功能发生障碍。我们将标记线粒体的DPSC（即DPSC-COX8A-DsRed2）与辐射损伤的IEC-6细胞进行共培养，成功捕获了DPSC向辐射损伤的IEC-6细胞递送线粒体这一生物学现象。本研究工作为后续开展DPSC 向辐射损伤肠上皮细胞中转移线粒体所带来的生物学效应及其转移机制研究提供了有用的工具。