基于PI3K/AKT/GSK3β信号通路探讨“还神至圣汤”对AD大鼠学习记忆的影响

刘洁，潘嘉，张力涵

阿尔茨海默病（AD）在中医学属于“呆病”、“健忘”、“癫病”等范畴，主要病机特点是由于年迈体虚，久病不复等导致五脏精气虚衰，痰瘀阻痹，渐使脑髓亏虚，脑髓失养，神机失用所致。其病位在脑，归于心，与五脏功能失调密切相关。根据中医虚者补之，实则泻之的原则，补益虚损，解郁散结为治则。还神至圣汤出自《辨证录》卷四，处方记载为，人参一两，白术一两，茯神5钱、生枣5钱，广木香3钱、制天南星3钱、荆芥3钱，甘草1钱、良姜1钱、附子1钱、枳壳1钱，菖蒲5分。主治呆病，具有开郁逐痰，健胃通气之功效。本研究采用大鼠海马区注射Aβ25-35淀粉酶建立AD模型，研究还神至圣汤对AD大鼠学习记忆能力的影响、探讨其可能的作用机制，为临床上本方剂用于治疗AD患者提供可靠的理论依据及实验基础。

1 材料

1.1 实验药物

根据《中国科学技术史·度量衡卷》考证的明清时期一两约36.8 g，一钱约3.68 g，一分约0.37 g折算，参考《中华人民共和国药典》（2020版）第一部推荐处方的用法用量并结合临床医师用药经验，将还神至圣汤处方调整如下：人参5 g，白术20 g，茯神20 g、生枣20 g，广木香3 g、制天南星3 g、荆芥9 g，甘草3 g、良姜3 g、附子3 g、枳壳3 g，菖蒲10 g。处方共计药材102 g为成人一天用量。依据陈奇主编《中药药理研究方法学》（1993年）第1版附录二“实验动物与人用药量换算”，以及黄继汉发表的《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》，设定本实验研究药物低、中、高剂量分别为10.2、20.4、40.8 g·kg-1，相当于临床剂量6倍，12倍，24倍。上述药材均为免煎颗粒，购于成都中医药大学附属医院，生产商：四川新绿色药业科技发展有限公司。

1.2 动物

SD大鼠，50只，雄性♂，180-200 g，购自四川省中医药科学院。动物生产许可证号SCXK(川)2018-19，实验动物使用许可证SYXK(川)2018-100。所有大鼠饲养于符合SPF的环境中（温度20±2℃、湿度50%-70%、昼夜各12 h）。本研究经四川省中医药科学院动物中心伦理委员会批准，决议编号SYLL(2022)-054，实验设计及实施过程中严格遵循动物实验3R原则。

1.3 试剂

AKT，P-AKT，GSK3β，PI3K（abcam，ab179463，ab192623，ab280376，ab191606）。P-GSK3β(ser9)（CST， 5558T）。BCA蛋白定量试剂盒（Thermo， PICPI23223）。Aβ25-35淀粉酶(Sigma， 0000113656）-20℃避光保存，使用前溶解在0.9%的无菌的生理盐水，配成浓度2.0 g.L-1，37℃孵育1周，使其成聚集态，然后置于-20℃冰箱保存备用。戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，WS20051129)。

1.4 仪器

68000系列大鼠脑定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；78001微型手持颅钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；Morris水迷宫及视频分析系统(成都泰盟公司， WMT-100)；电泳仪(美国BIORAD，mini protean 3 cell)。电转仪（美国HOEFER，TE77XP）；酶标仪（美国PE, Victor Nivo）；成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon-5200）。

2 方法与结果

2.1 动物分组建模与给药

50只SD大鼠按体重随机分成5组，每组10只，设正常对照A组、模型对照B组、实验药物低剂量10.2 g.kg-1（C组）、中剂量20.4 g.kg-1（D组）、高剂量40.8 g.kg-1（E组）。动物适应性喂养1周，除正常对照A组外，其余各组动物按如下操作建立老年痴呆AD大鼠模型。各组动物腹腔注射60 mg.kg-1戊巴比妥钠麻醉，将麻醉大鼠固定于脑立体定位仪，剪开头部皮肤，暴露头骨。于前囟后3.5 mm，中线旁开2 mm，硬脑膜下2.9 mm定位双侧海马，并用颅骨钻钻孔。除假手术组外，采用微量注射泵于5 min内缓慢注射5 μL（10 μg）老化1周的Aβ25-35淀粉样蛋白溶液于大鼠右侧大脑海马组织，假手术组注射等量无菌生理盐水。采用齿科水门汀封闭颅骨，缝合皮肤。每日连续腹腔注射青霉素钠10万U.只-1，连续3日，防止感染。模型建立后14天，实验动物进行Morris水迷宫实验。模型建立第2天，各组动物常规灌胃给药，每日按照100 g.mL-1常规灌胃给予大鼠，连续给药30天，正常对照组、模型组给予等体积生理盐水。每周对实验大鼠称重1次，并根据体重调整给药体积。给药结束后24 h，大鼠用戊巴比妥钠麻醉腹股沟放血处死，并剖取大鼠大脑的左右侧海马组织，并置于-80℃冰箱保存备用。

2.2 Morris水迷宫实验

Morris 水迷宫实验分为前5 d的定位航行实验和第 6 d 的空间探索实验。将水迷宫圆形水池分为四个象限， 逃生平台置于其中一个象限内。第 1 d 至第 5 d 进行训练实验，每天上午和下午的固定时间训练一次， 将大鼠面向池壁从除平台之外的其它三个象限随机放入水中，记录大鼠在120 s内找到平台的时间即逃避潜伏期，大鼠找到平台后或120 s内找不到平台（潜伏期记为120 s），则由实验者将其引导到平台，在平台上停留20 s。连续训练4天观察记录大鼠从入水到找到安全平台所需的潜伏时间，每日以大鼠2次训练的潜伏期平均值作为当日的学习成绩。实验第5 d，进行定位巡航实验，记录每只大鼠从入水到找到平台所需的潜伏期时间。实验第6 d进行空间探索实验，撤掉安全平台，大鼠从任一入水点放入水中，记录大鼠在目标象限停留时间百分比。

2.3 免疫印迹Western blot实验

将大鼠右侧海马组织匀浆加入RAPI裂解液至细胞完全裂解后充分震荡。裂解后的样品于4℃，12000 r·min-1离心15 min，取上清液，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。根据BCA方法检测蛋白浓度，蛋白变性。按照上样量为15 μg蛋白，计算上样量。电泳结束后用PVDF膜转印。5%脱脂奶粉液封闭1 h，一抗，根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2 h或4℃孵育过夜。 二抗，孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次5 min。随后根据用量，按照1:1000稀释HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1 h。用TBST洗涤3次，每次5 min。滴加 ECL 工作液并曝光拍照， 用 Image J 软件定量分析目的蛋白条带，进行灰度分析。

2.4 统计学方法

2.5 结果

2.5.1 还神至圣汤对AD大鼠学习记忆功能的影响 Mor-ris 水迷宫实验结果显示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠平台逃避潜伏期延长，穿越平台次数和目标象限停留时间的百分比明显减少( P＜0.05) 。与模型对照组相比，还神至圣汤（相当于原生药）10.2、20.4、40.8 g.kg-1剂量组平台逃避潜伏期明显减少，穿越平台次数和目标象限停留时间百分比明显增加( P＜0.05)。说明还神至圣汤各剂量可改善由Aβ25-35淀粉样蛋白诱导的AD模型大鼠的学习记忆能力。见表 1，表2。

表1 还神至圣汤对AD大鼠平台逃避潜伏期的影响（± s，n=10）

表1 还神至圣汤对AD大鼠平台逃避潜伏期的影响（± s，n=10）

注：与正常对照组比较，模型对照组△P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05

平台逃避潜伏期（s）D1D2D3D4D5正常对照组NS57.8±16.050.6±14.841.3±9.732.9±10.926.3±8.6模型对照组NS69.9±5.5△65.10±6.6△57.4±15.2△46.90±11.5△38.2±10.6△药物低剂量组10.261.5±8.4*52.9±13.5*43.1±8.5*33.4±12.3*27.5±6.5*药物中剂量组20.461.1±8.1*53.5±14.2*44.00±7.8*32.9±11.7*28.4±10.2*药物高剂量组40.853.5±7.2*52.60±15.9*43.20±12.0*33.1±13.2*27.1±7.8*组别剂量g.kg-1

表2 还神至圣汤对AD大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间百分比的影响（± s，n=10）

表2 还神至圣汤对AD大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间百分比的影响（± s，n=10）

注：与对照组比较，模型对照组△P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05

组别剂量g.kg-1穿越平台次数/n 目标象限停留时间/%正常对照组NS5.2±1.536.8±11.4模型对照组NS2.8±1.6△22.2±6.4△药物低剂量组10.24.4±1.0*29.3±8.1*药物中剂量组20.44.5±1.4*29.7±9.1*药物高剂量组40.84.3±1.2*30.1±8.4*

2.5.2 还神至圣汤对AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3 β、p-GSK3β蛋白表达的影响 Western blot实验结果可知，与对照组比较，模型对照组PI3K、p-Akt、p-GSK3β在ser9位点蛋白表达明显降低（P＜0.05）,而AKT、GSK3β蛋白含量无明显变化（P＞0.05）。与模型对照组比较，还神至圣汤各剂量组AKT、GSK3β蛋白表达无明显变化（P＞0.05）; 而20.4 、40.8 g.kg-1剂量组PI3K、p-Akt蛋白含量增加明显，20.4 g.kg-1剂量组p-GSK3β在ser9位点蛋白含量也明显增加（P＜0.05）。模型对照组p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β比值明显降低（P＜0.05），而20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1剂量组比值相对模型对照组有明显增加（P＜0.05），表明还神至圣汤中、高剂量可上调由Aβ25-35淀粉样蛋白引起的AD模型大鼠海马组织PAkt、p-GSK3β在ser9位点蛋白含量表达（表3、4、图1-3）

图1 PI3K/Akt/GSK-3β信号通路及其相关蛋白表达情况

图3 各组大鼠GSK-3β磷酸化/GSK-3β比较

表3 还神至圣汤对AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影响（± s，n=10）

表3 还神至圣汤对AD大鼠PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白含量的影响（± s，n=10）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

p-GSK3β/β-actin正常对照组NS0.496±0.0090.852±0.0110.446±0.0270.844±0.0450.394±0.030模型对照组NS0.377±0.015△0.892±0.0720.287±0.015△0.843±0.0260.289±0.055△药物低剂量组10.20.389±0.0090.860±0.0200.317±0.0370.838±0.0550.397±0.156药物中剂量组20.40.439±0.035*0.868±0.0200.382±0.056*0.752±0.0960.410±0.134药物高剂量组40.80.452±0.029*0.849±0.0070.396±0.034**0.845±0.0030.441±0.077*组别剂量g.kg-1PI3K/β-actinAkt/β-actinp-Akt/β-actinGSK3β/β-actin

表4 还神至圣汤对AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影响（± s，n=10）

表4 还神至圣汤对AD大鼠p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白含量比值的影响（± s，n=10）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05，*P＜0.01

组别剂 量g.kg-1p-Akt/AKTp-GSK3β/GSK3β正常对照组NS0.533±0.0390.461±0.011模型对照组NS0.328±0.013△0.345±0.056△药物低剂量组10.20.356±0.0360.517±0.160药物中剂量组20.40.440±0.064*0.560±0.103*药物高剂量组40.80.476±0.040**0.495±0.092*

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)是一种以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，是中老年痴呆的主要原因。临床上以近似记忆力下降为明显特征，并逐步发展为注意力、计算力、执行力等下降的全面痴呆，同时伴有精神人格改变及日常生活能力下降，给患者、家庭及社会带来了严重困扰及负担。随着全球人口老龄化的快速进展，AD的发病率逐年增加。据2021年《中国阿尔茨海默病报告2021》，我国AD发病率已超过1000万人口，全球超5000万，预计到2050年，全球AD患者数量将上升至1.52亿。

目前比较认可AD的发病机制为：①Tau蛋白异常聚集，成对的螺旋状纤维转化为 NFTs，微管稳定性降低导致突触丢失，神经元功能受损，最终导致大脑神经退行性病变和神经元死亡。②大脑海马区β-淀粉样蛋白在细胞外沉积形成老年斑SP。③突触连接丢失及突触功能异常；④相关基因学说，如APP、PSEN1/2、ApoE基因等；⑤免疫异常学说，大脑中过度的炎性反应激活引起神经元损害和死亡；⑥早期细胞因子功能障碍。[1,2]

还神至圣汤出自《辨证录》卷四，主治呆病，具有开郁逐痰，健胃通气之功效。方中诸药合用，扶正祛邪，标本兼顾，为呆病治疗之良方。本课题基于方剂治疗呆病的中医理论及临床经验，研究方剂对AD大鼠学习记忆能力的影响。Morris水迷宫实验研究表明，还神至圣汤10.2 g.kg-1、20.4 g.kg-1、40.8 g.kg-1剂量组可明显减少AD模型动物平台逃避潜伏期，增加穿越平台次数和目标象限停留时间百分比 ( P＜0.05)，表明药物可改善由 Aβ25-35淀粉样蛋白致AD模型大鼠的学习记忆能力。

PI3K /Akt 信号通路是细胞内抗凋亡，参与细胞增殖、分化的重要信号转导通路。Akt是PI3K信号通路下游靶分子，在PI3K依赖激酶( PI3K-dependent kinase，PDK) 的作用下，Akt的磷酸化被激活调节细胞生长和迁移细胞的生存功能，调控下游蛋白。GSK3β是Akt主要下游靶分子之一，也是Tau蛋白磷酸化关键的调节酶[3,4]，GSK-3β在Ser9位点磷酸化能抑制Tau蛋白磷酸化，从而抑制 Aβ的聚集[5]。PI3K /Akt /GSK3β信号通路与AD神经元的形态及功能结构改变具有相关性，并能够维持神经干细胞存活，影响AD的发生和发展[7,8]。Western blot实验结果表明，模型对照组PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位点蛋白表达明显降低（P＜0.05）, 而AKT、GSK3β蛋白含量无明显变化（P＞0.05），导致Aβ聚集增加，模型动物脑内PI3K/AKT/GSK-3β信号通路活性明显降低。还神至圣汤20.4、40.8 g.kg-1中、高剂量可上调PI3K、p-Akt、p-GSK3β在Ser9位点蛋白含量，从而上调p-Akt/AKT、p-GSK3β/GSK3β的比值，抑制Aβ聚集，降低其神经毒性作用。

综上所述，还神至圣汤可改善 AD 大鼠学习记忆能力，其改善AD大鼠学习记忆能力的作用机制与PI3K /Akt /GSK3β信号通路有关，但更具体的机制还有待更加深入的研究。