红景天苷对离体血管的张力作用研究

陈洁，张雅婷，安文乔，陈小睿，张艺，张三印，孟宪丽，王小博

血管张力是血管类疾病诊断的重要指标，血管张力失调是血管类疾病发生发展的病理过程，也是此类疾病继续加重的主要原因[1]。心血管类疾病是导致人类死亡的元凶之一。其具有高患病率、高致残率、高死亡率的特点[2]，严重威胁了人类健康。此类疾病侵袭人体各类血管，其中脑动脉、颈动脉、冠脉、主动脉是主要的罹患部位。因此针对血管张力变化开发的药物和治疗途径成为解决血管类疾病的突破口[3]。近年来，传统藏药红景天在防治心血管疾病的医疗运用中取得了良好的成效[4,5,6]。因此进一步探究红景天防治心血管疾病的作用机制具有着重要的临床意义。本文旨在探讨红景天的主要活性成分红景天苷对不同组织离体血管张力的药理作用以及引起血管最大舒缩的浓度。

1 材料

1.1 药物

红景天苷是藏药红景天的提取物，为其有效成分之一，分子式为C14H20O7。本实验所用红景天苷（98%，货号S25475）购自上海源叶生物科技有限公司。红景天苷溶液配制如下：

红景天苷溶液制备 溶剂：PSS溶液。溶质浓度：SAL（1500 μg·mL-1）。

1.2 动物

正常雄性Sprague-Dawley大鼠，5～7周龄，220～250 g，购自成都恩斯维尔生物科技有限公司。许可证号SCXK(湘)2019-0004。动物饲养于成都中医药大学药学院，饲养期间自由进食饮水。饲养环境温度维持在22～27℃，相对湿度维持在45%～55%，昼夜光照及通风环境自然调节。动物在饲养一周后开始实验。

1.3 试剂

分析纯碳酸氢钠（ N a H C O3， 批号：2020061001）；分析纯葡萄糖（D-glucose，批号：20070115）；分析纯磷酸二氢钾（KH2PO4，批号：20160517）；分析纯氯化钙（CaCl2，批号：2020080301）；分析纯氯化镁（MgCl2，批号：201604068）；分析纯氯化钠（NaC，l批号：2015021401）；均购自成都市科龙化工试剂厂；4-羟基哌嗪乙磺酸（HEPES，批号：S872）购自山东西亚化学股份有限公司。9,11-二脱氧基-11a,-亚甲基环氧前列腺素（U46619，批号：D8174）购自成都瑞信生物技术有限公司。本实验所用各溶液配制如下：

PSS溶液制备 溶剂：超纯水。溶质浓度：NaCl（6891.2 μg·mL-1）, KCl（350.15 μg·mL-1）,CaCl2（277.5 μg·mL-1）, KH2PO4（163.3 μg·mL-1）,MgCl2（244 μg·mL-1）, NaHCO3（2100 μg·mL-1）,D-glucose（1982.2 μg·mL-1）和HEPES（1191.5 μg·mL-1），PH=7.4。

KPSS溶液制备 溶剂：超纯水。溶质浓度：NaCl（467.2 μg·mL-1）, KCL（4476 μg·mL-1） ,CaCl2（277.5 μg·mL-1）, KH2PO4（163.3 μg·mL-1）,MgCl2·6H2O（244 μg·mL-1）, NaHCO3（2100 μg·mL-1）, D-glucose（1980 μg·mL-1）和HEPES（1191.5 μg·mL-1）， PH=7.4[7]。

1.4 实验设备

DZKW-S-4型水浴锅（上海跃进有限公司）；BSA124S-CW型Sartorius精密天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；离体血管620M微血管张力测定系统（丹麦DMT公司）；Power Lab生物信号采集分析系统及张力换能转换器（美国ADinstruments公司）；SZX2-ILLT解剖显微镜（日本Olympus公司）；PHS-3C精密pH测定仪（衢州艾普计量仪器实力供应商）；04400506实验室纯水系统（Millipore公司）；可调式移液枪（Thermo Fisher Scientific公司）；MLT0201型张力换能器、Labchart专业软件（埃德仪器国际贸易有限公司）。

2 方法

2.1 分组给药

选取SD大鼠大脑中动脉、基底动脉、颈动脉、肺动脉、冠状动脉、腹主动脉、胸主动脉、肠系膜动脉、股动脉，各6段制备血管环。分别设置空白组，实验组在浴槽内进行不同浓度的红景天苷给药处理：0.3，1.5，3，6，9，15，30，60.1，120.1，240.2，480.5，961，1111.1，1261.2，1411，1561，1711，1861 μg·mL-1。如果加药给到1861 μg·mL-1，血管仍有明显收缩，需持续给药到血管无明显变化。若加到1861 μg·mL-1仍无明显效果，可直接加到2336 μg·mL-1。

2.2 大鼠动脉环制备

2.2.1 脑动脉环制备 取健康雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后快速取出完整脑组织放入准备好的培养皿中，培养皿内装满4℃ PSS 溶液。将脑组织仰放，找到大脑中动脉和基底动脉。剪出2 mm的血管环、用两根直径25 μm，长1.5 cm的钨丝穿过血管环。将血管环放入钳口并分别固定在DMT浴槽内同侧的2个螺丝上。再将浴槽放在DMT上，调节血管张力后平衡30分钟。实验过程中浴槽内溶液持续通入95% O2和5% CO2的混合气体，温度控制在37℃。全程使用生物 powerlab机能实验系统记录血管张力。

2.2.2 冠状动脉环制备 取健康雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后快速取出心脏放入准备好的培养皿中，培养皿内装满4℃ PSS 溶液并用针灸针固定心脏的位置。在显微镜下小心剔除血管周围组织，依次分离出冠脉的室间隔支、室壁支和前降支，剪出2 mm的血管环。余下步骤同上。

2.2.3 肺动脉环制备 取健康雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后快速取肺组织放入准备好的培养皿中，培养皿内装满4℃ PSS 溶液并用针灸针固定肺组织的位置。在显微镜下小心剔除血管上的脂肪分离出动脉血管。剪出2 mm的血管环，余下步骤同上。

2.2.4 肠系膜动脉环制备 取健康雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后快速剪取一段肠组织放入准备好的培养皿中，培养皿内装满4℃ PSS 溶液并用针灸针固定肠的位置。在显微镜下小心剔除肠系膜血管上的脂肪分离出动脉血管。剪出2 mm的血管环，余下步骤同上。

2.2.5 大动脉环制备 取健康雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死后快速取出一截胸主动脉放入准备好的培养皿中，培养皿内装满4℃ PSS 溶液。注意被镊子夹取的那部分血管活性较差，需在培养皿中剪去。剪出2 mm的血管环。余下步骤同上。颈总动脉、腹主动脉、股动脉操作同胸主动脉，上述所取血管如图1所示。

图1 实验所取血管示意图

2.3 血管环的活性、稳定性验证

待上述血管环张力稳定后，将浴槽内的PSS溶液更换成5 mL KPSS溶液。维持10 min后用5 mL PSS溶液清洗三次每次间隔3 min。待血管环张力再次稳定后将溶液更换成5 mL KPSS溶液，维持10 min。观测血管收缩曲线，第一次用KPSS溶液刺激，血管收缩应大于2毫牛，表示血管活性良好。第二次用KPSS溶液刺激，血管收缩的幅度相差不超过10% 说明血管稳定性良好。可用于下一步实验。

2.4 血管张力测定

使用氯化钾60 mmol·L-1收缩血管，待血管收缩达到坪台后开始给药。实验组：在浴槽内累积加入不同浓度的SAL。对照组：SAL 0 μg·mL-1。以高钾溶液（4476 μg·mL-1）所致的收缩为100%，计算SAL的血管舒张强度，并计算抑制率。

2.5 统计学处理

实验数据均采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料以±S表示，t检验法用于两组之间比较，单因素方差分析法用于多组间比较。用Graph Pad Prism 6计算IC50值。

3 结果

3.1 红景天苷对大脑中动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的大脑中动脉（MCA）张力变化的浓度-效应记录图，如图2（C）所示。Sal对KCl预收缩MCA表现出双向调节作用，当给药浓度为60.1 μg·mL-1时，Sal对MCA造成最大收缩，最大收缩率为65.43±17.89%（P＜0.01）；浓度大于961 μg·mL-1后，浓度依赖性舒张MCA，并在1261 μg·mL-1时达到最大舒张率49.01%±22.04%（P＜0.05）,如图2（A）所示。其IC50值为1241.4 μg·mL-1，如图2（B）所示。

图2 红景天苷对大脑中动脉的张力调节（±S，n=6）

3.2 红景天苷对大脑基底动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的大脑基底动脉（BA）张力变化的浓度-效应记录图，如图3（C）所示。与空白对照组比较。Sal对KCl预收缩BA表现出双向调节作用，当给药浓度为9 μg·mL-1时，Sal对BA造成最大收缩，最大收缩率为20.09±6.11%（P＜0.01）；给药浓度浓度达到961 μg·mL-1后，浓度依赖性舒张BA，最大舒张率为96.47±7.90%（P＜0.01）。如图3（A）所示。其IC50值为1230.3 μg·mL-1，如图3（B）所示。

图3 红景天苷对大脑基底动脉的张力调节（±S，n=6）

3.3 红景天苷对颈总动脉的作用

红景天苷（Sal）组对U46619（3.333×10-2 μg·mL-1）预收缩的颈总动脉（CCA）张力变化的浓度-效应记录图，如图4（C）所示。与空白对照组比较，Sal对CCA表现出双向调节作用。Sal对颈总动脉虽表现出双向调节作用，但其作用不强，且与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。如图4（A）所示。其IC50值为11498.7 μg·mL-1，如图4（B）所示。

图4 红景天苷对颈总动脉的张力调节（±S，n=6）

3.4 红景天苷对肺动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的肺动脉（PA）张力变化的浓度-效应记录图，如图5（C）所示。与空白对照组比较，Sal对PA表现出浓度依赖性舒张血管的作用。当给药浓度达到480.5 μg·mL-1以上时有显著性差异，当给药浓度为2336 μg·mL-1时，Sal对PA造成最大舒张，最大舒张率为99.20±1.79%

图5 红景天苷对肺动脉的张力调节（±S，n=6）

3.5 红景天苷对冠脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的冠脉张力变化的浓度-效应记录图，如图6（C）所示。与空白对照组比较，Sal对冠脉表现出浓度依赖性舒张血管的作用。当给药浓度达到480.5 μg·mL-1以上时有显著性差异，当给药浓度为1111.1 μg·mL-1时，Sal对冠脉造成最大舒张，最大舒张率为100%（P＜0.01）；如图6（A）所示。其IC50值为125.7 μg·mL-1，如图6（B）所示。

图6 红景天苷对冠脉的张力调节（±S，n=6）

3.6 红景天苷对胸主动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的胸主动脉张力变化的浓度-效应记录图，如图7（C）所示。与空白对照组比较，Sal对胸主动脉表现出双向调节作用，但收缩作用不强。给药浓度为 60.1 μg·mL-1时，产生最大收缩，最大收缩率为 16.08%±3.96%（P＜0.01）；浓度达到 961 μg·mL-1后，表现出浓度依赖性舒张作用，最大舒张率可达到 97.23%±1.67%（P＜0.01）。如图7（A）所示。其IC50值为1488.9 μg·mL-1，如图7（B）所示。

图7 红景天苷对胸主动脉的张力调节（±S，n=6）

3.7 红景天苷对腹主动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的腹主动脉张力变化的浓度-效应记录图，如图8（C）所示。与空白对照组比较，低浓度时（0.3-6 μg·mL-1）Sal对腹主动脉表现出较弱的收缩作用；随着浓度增大，其对腹主动脉表现出较强的舒张作用其舒张血管的趋势基本呈浓度依赖性，最大舒张率为87.50%±12.15%（P＜0.01）。如图8（A）所示。其IC50值为759.3 μg·mL-1，如图8（B）所示。

图8 红景天苷对腹主动脉的张力调节（±S，n=6）

3.8 红景天苷对肠系膜动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的肠系膜动脉张力变化的浓度-效应记录图，如图9 (C)所示。与空白对照组比较，给药浓度为0.3-480.5 μg·mL-1时，Sal对肠系膜动脉表现为收缩血管作用；之后随着浓度增大，作用表现为浓度依赖性舒张，并在2011 μg·mL-1时达到最大舒张86.06%±11.48%（P＜0.01）；如图9（A）所示。其IC50值为1491 μg·mL-1，如图9（B）所示。

图9 红景天苷对肠系膜动脉的张力调节（±S，n=6）

3.9 红景天苷对股动脉的作用

红景天苷（Sal）组对KPSS溶液预收缩的股动脉张力变化的浓度-效应记录图，如图10 (C)所示。与空白对照组比较，给药浓度为0.3-480.5 μg·mL-1时，Sal对股动脉表现为收缩血管作用；之后随着浓度增大，作用表现为浓度依赖性舒张，并在2011 μg·mL-1时达到最大舒张90.08%±14.15%（P＜0.01）；如图10（A）所示。其IC50值为1227 μg·mL-1，如图10（B）所示。

图10 红景天苷对股动脉的张力调节（±S，n=6）

4 讨论

传统藏药红景天生长于高海拔（1600～4000 m）、高寒和缺氧地区。藏医药典籍《四部医典》也有关于红景天的记载，言其“性平、味涩、善润肺、能补肾、理气养血。主治周身乏力、胸闷、恶心、体虚等症。《中华抗衰老医学》记载红景天：味甘涩性平，有滋补强壮、补肾、壮阳、强心、补血、活血等功效，用于治疗贫血、低血压、自主性血管张力不足，老年心功能衰竭等症。提示红景天可能调节血管张力。红景天苷（salidroside, SAL）是传统藏药红景天的主要活性成分。具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗代谢失调和神经保护[8,9]的作用。已有研究证实红景天苷可以通过抑制缺氧诱导因子-1α 基因表达，抑制血管内皮收缩 因子内皮素-1 的表达，促进血管内皮舒张因子 NO 合酶表达，从而改善低氧诱导的血管内皮舒缩功能障碍[10]。但红景天苷对不同类型的血管的调节作用尚不明确。为了确定红景天苷对血管张力调节的作用，我们选择了动脉血管中九种代表性血管进行研究。

高钾溶液（4470 μg·mL-1的KCL）是诱导离体血管收缩常用的物质，为了观察红景天苷对收缩状态下动脉条张力的影响，我们采用高钾溶液预收缩血管条。实验结果：（1）根据IC50显示红景天苷对血管舒张作用效果从强到弱：冠状动脉＞腹主动脉＞股动脉＞肺动脉＞基底动脉＞大脑中动脉＞胸主动脉＞肠系膜动脉＞颈总动脉。（2）SAL对脑中动脉、基底动脉、胸主动脉、腹主动脉、肠系膜动脉、股动脉有双向调节作用，随着SAL给药浓度增加，上述动脉均有收缩后舒张的趋势。SAL浓度依赖性舒张肺动脉、冠状动脉血管。

血管张力调节主要有内皮依赖性和非内皮依赖性两种方式[11]。血内皮依赖性调节是指可以通过内皮细胞控制释放血管张力调节因子来调节血管张力；如释放型利钠肽等调节血管舒张，释放内皮素和血栓素A2 等来控制血管收缩。非内皮依赖性可以通过刺激血管，调节血管平滑肌上的钙、钾离子通道来控制血管收缩。有关红景天苷对血管作用的具体机制，我们将在随后的研究中采用一氧化氮合酶抑制剂、钙离子通道阻滞剂、钾离子通道阻滞剂等系列工具药进行进一步深入探讨。