HPLC同时测定明目益睛丸中5种有效成分含量

杨春红，李 睿，赵 琪，石倩，刘雅琴，赖先荣，李姝

明目益睛丸是由眉山市中医医院自制的院内制剂，由盐菟丝子、五味子、青皮、盐车前子、三七等10味中药材组成，具有滋阴补肝肾、益气生津的药用功效。该方临床用于治疗肝肾亏虚，目失濡养所致的近视、糖尿病性视网膜病变、视网膜脱离、视神经萎缩等各类眼病[1-2]。作为经验方剂，目前对其质量控制系统研究较少。根据现有药理研究，菟丝子补益肝肾，明目，主要成分金丝桃苷可抗肝损伤、保护肾脏，还能改善糖尿病高血糖引起的视网膜病理损伤[3]；五味子补虚益目，五味子醇甲具有保肝护肝、抗炎作用[4]；青皮理气，橙皮苷参与抗炎、保肝作用[5]；车前子利水清热明目，毛蕊花糖苷具有明显的抗炎及肝保护作用，还可改善肾功能[6]；三七行血气，其中人参皂苷Rg1作为主要药效成分可保护视网膜、显著护肝及抗炎[7]。为对明目益睛丸进行质量控制，本实验以上述5种物质作为明目益睛丸的有效成分，建立高效液相色谱法含量测定方法，为后续质量标准研究提供科学依据及参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），HTP-312型电子天平（上海花潮电器有限公司），BSA124S型电子分析天平、CPA225D型电子分析天平均购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，KQ-50B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），RATK060L0乐枫超纯水系统（上海乐枫生物科技有限公司）

图1 专属性试验HPLC图A. 空白溶液；B. 混合对照品溶液；C. 供试品溶液；D. 缺盐菟丝子阴性对照溶液；E. 缺盐车前子阴性对照溶液；F. 缺青皮阴性对照溶液；G. 缺三七阴性对照溶液；H. 缺五味子阴性对照溶液1.金丝桃苷；2.毛蕊花糖苷；3. 橙皮苷；4.人参皂苷Rg1；5.五味子醇甲

1.2 试剂与对照品

明目益睛丸（自制，批号M Z 2 2 111 8-1、MZ221118-2、MZ221118-3），乙腈及甲醇为色谱纯，均购于Sigma（中国）有限公司；磷酸（色谱纯）、甲醇（分析纯）均购于成都市科隆化学品有限公司。

对照品由成都德思特生物技术有限公司提供，纯度均大于98.0%：金丝桃苷（批号：DST210912-023）、橙皮苷（批号：DST220704-038）、五味子醇甲（批号：DSTDW001001）、毛蕊花糖苷（批号：DSTDL006101）、人参皂苷Rg1（批号：DSTDR000902）

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate®ODS-3（4.6×250 mm，5 μm），柱温30℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：203 nm，洗脱序列见表1。

表1 流动相梯度洗脱时间表

2.2 溶液制备

对照品溶液制备：精密称取金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1适量，甲醇稀释，制成质量浓度分别为0.530 mg/mL、0.517 mg/mL、0. 871 mg/mL、0.556 mg/mL、0.744 mg/mL，作为对照品储备液。分别精密移取上述各储备液适量，甲醇稀释制成质量浓度为0.0530 mg/mL、0.0510 mg/mL、0.0871 mg/mL、0.0556 mg/mL、0.0744 mg/mL混合对照品溶液。

供试品溶液制备：取自制明目益睛丸粉末2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入85%甲醇40 mL，称重，超声50 min，放冷，用85%甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

阴性对照品溶液制备：按处方比例，分别取缺盐菟丝子、五味子、青皮、盐车前子、三七采用同供试品制备工艺，制备阴性样品后，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取空白溶液与2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。由图1可知，各成分峰形完整，与其他相邻峰分离度均大于1.5，且空白溶液及阴性对照品相应位置处无干扰峰出现，表明该方法专属性良好。

2.3.2 线性试验 精密量取2.2项下对照品溶液，加甲醇适量稀释成系列梯度，按“2.1”项下色谱条件分别进样测定，并记录峰面积。以浓度（μg·mL-1）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），结果见表2，各成分r均大于0.9995，表明线性关系良好。

表2 线性试验结果

2.3.3 精密度试验 照2.2项下制备供试品溶液，于同一天内连续进样6次，记录峰面积。结果，金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1峰面积的RSD均小于3%，分别为0.71%、0.74%、2.24%、0.20%、0.37%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，放置0、2、4、6、8、12、18、24 h后，照2.1项下进样测定并记录峰面积。结果，5个化学成分峰面积的RSD均小于3%，依次为0.46%、0.74%、0.20%、0.52%、1.89%，说明该方法在24 h内稳定性较好。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批次明目益睛丸样品共6份，按“2.2”项下制备供试品溶液，照“2.1”项下条件进样测定，并记录峰面积。根据线性曲线方程计算各成分含量。结果见表，5种成分的RSD均小于3%，表明该方法重复性较好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的明目益睛丸6份，每份约1.0 g，精密称定，按已知含量的100%加入混合对照品，照2.2项下方法制备供试品溶液，同2.1项下进样条件进行测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.4 含量测定

取3批自制明目益睛丸，按2.2项下制备供试品溶液后，照2.1项下进样条件进行含量测定，各批次平行测定3次，5种有效成分平均含量结果见表4。

表4 5种有效成分含量测定结果（n=3）

3 结论与讨论

本实验采用HPLC同时测定明目益睛丸中金丝桃苷、五味子醇甲、橙皮苷、毛蕊花糖苷、人参皂苷Rg1成分含量。该检测方法下各成分线性曲线相关系数≥0.9995，精密度、重复性及稳定性的RSD值均小于3%，加样回收率在90%～110%之间，表明该方法稳定可行。

在测定各成分含量时，对流动相进行了考察，选择乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水进行梯度洗脱，结合峰形分离度及响应值等因素，最终确定以乙腈-0.1%磷酸水作为本实验流动相条件。同时分别对柱温25℃、30℃、35℃及流速0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min进行考察，确定以柱温30℃、流速1 mL/min作为此实验的进样条件。

本实验所建立的方法重现性好、稳定可靠，为明目益睛丸的有效成分含量测定提供了简便方法，同时为相关质量标准的进一步研究提供科学依据及实验基础。