CD276在泛癌中的免疫表达及预后

张癸乾，王宁，荣耀，唐明政，蔡辉

（1.甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000；2.甘肃省人民医院临床普外中心，兰州 730000；3.国家卫生健康委胃肠肿瘤诊治重点实验室，甘肃省人民医院，兰州 730000；4.甘肃省外科肿瘤分子诊断与精准治疗重点实验室，甘肃省人民医院，兰州 730000）

癌症在大多数国家是70岁以下人群主要或次要的死亡原因［1］，由于存在药物耐受性和癌症复发等问题，患者的生存率低［2］。泛癌分析可以用来区分人类恶性肿瘤的特征，为临床治疗提供新思路。

CD276（B7-H3）是B7超家族的分子之一，该基因所编码的蛋白属于免疫球蛋白家族［3］，参与调节T细胞介导的免疫反应［4］。CD276被认为是T细胞的刺激蛋白，但许多研究［5］表明，CD276作为T细胞的抑制因子，能够促进肿瘤的侵袭和增殖，CD276与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的黏附有关。尽管该基因的转录本在正常组织和实体瘤中都很常见，但该蛋白只在肿瘤组织中优先表达［6］。因此，本研究综合分析了泛癌中CD276的表达水平，旨在探究CD276与肿瘤预后及免疫浸润的相关性，从而为癌症治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 样本数据收集

通过癌症基因组图谱（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载临床数据。通过UCSC Xena（https：//xena.ucsc.edu/）从TCGA数据库下载33种不同癌症类型的信息。通过GTEx（https：//gtexportal.org/）下载来自449例健康捐赠者的7 000余份样本，涵盖44种组织。

1.2 CD276在泛癌中的表达及预后分析

从TCGA数据集（https：//portal.gdc.com）下载了泛癌的RNA测序表达（3级）谱和相应的临床信息。总生存期（overall survival，OS）、疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）、无病生存期（disease-free survival，DFS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）用来研究CD276表达与患者生存之间的关系。以CD276表达水平的中位数为阈值，将患者分为高表达组和低表达组。采用R语言survival和survminer包来显示患者的生存情况。

1.3 CD276与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）相关性分析

利用R语言ggplot2、ggpubr和 ggExtra包来分析CD276表达和TME之间的相关性（以相关系数|r|＞0.2且P＜0.001为标准）。TMB、MSI和CD276表达之间的相关性用Spearman方法计算。R语言fmsb包用于图像可视化。

1.4 CD276与免疫细胞浸润相关性分析

采用CIBERSORT评估泛癌免疫细胞浸润情况。R软件包 “ggplot2”“ggpubr”和 “ggExtra”被用来分析CD276表达和细胞免疫浸润之间的相关性（以相关系数|r|＞0.2且P＜0.001为标准）。为了获得可靠的免疫评分，使用R语言immuneeconv包［7］。

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp）提供了基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组数据库（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的基因集。使用R语言limma、org.Hs.eg.db、clusterProfiler和 enrichplot包对GO和KEGG进行功能注释和路径富集分析。

1.6 细胞培养和实时PCR

胃癌细胞（HGC-27、MGC-803和MKN-45）和正常细胞（GES-1），结肠癌细胞（HCT116、SW620和SW480）及正常细胞（NCM460）来自中国科学院细胞资源中心。用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，于37℃，5%CO2培养箱中培养细胞。

采用TRIzol法从细胞中分别提取总RNA，用反转录试剂盒将纯化的RNA反转录成cDNA模板，然后对目标基因进行实时PCR，最后用2-ΔΔCt法计算CD276的相对表达量，并以GAPDH为内参照。CD276引物序列，正向，5’-TCACTGCAAAGATTTAC CATCAGC-3’，反向，5’-TGTCTTGGAGCCTTCTCCC-3’。GAPDH引物序列，正向，5’-GGAAGCTTGTCATCAA TGGAAATC-3’，反向，5’-TGATGACCCTTGGCTCCC-3’。

1.7 统计学分析

所有基因数据都通过对数转换进行归一化。CD276的差异表达采用Wilcox测试检测。数据的可视化由R语言（4.1.1版）处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD276在泛癌中高表达

利用TCGA数据库和GTEx数据库研究了CD276在不同肿瘤组织和正常组织中的表达水平。结果显示，CD276在肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma，ACC）、膀胱癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）和乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）等肿瘤中均高表达，见图1。

图1 CD276在泛癌中的表达Fig.1 CD276 expression in pan-cancer

2.2 CD276对泛癌预后的影响

生存分析结果显示，在ACC、BLCA和结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）等肿瘤患者中，CD276的高表达与不良OS和DSS相关（图2A、2B）；在ACC、BLCA和低度胶质瘤（lower grade glioma，LGG）等肿瘤中，CD276的高表达与低PFS相关，但在大B细胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma，DLBC）中则相反（图2C）；在ACC、宫颈癌（cervical cancer，CESC）和胆管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）等肿瘤中CD276的高表达与不良DFS有关（图2D）。

2.3 CD276在TME、TMB和MSI中的作用

TME通过刺激肿瘤细胞间的异质性并使其具有多药耐药性来促进肿瘤细胞的进展和转移。结果显示，在BLCA、COAD和LGG等肿瘤中，CD276的表达与基质细胞（图3A）和免疫细胞（图3B）得分呈正相关，说明基质细胞或免疫细胞的含量随着CD276表达水平的提高而增加。TMB是指100万个碱基中的碱基突变率。MSI是指与正常组织相比，由于基因的插入或缺失而在肿瘤的微卫星位点出现新的微卫星等位基因的现象。本研究结果显示，在ACC、BRCA和CESC等肿瘤中，CD276与TMB之间有明显的关联（图3C）；在COAD、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、直肠癌（rectal cancer，READ）和睾丸癌（testicular cancer，TGCT）中，CD276与MSI之间有明显的关联（图3D）。

2.4 CD276与免疫细胞浸润

采用CIBERSORT算法研究CD276表达与22种免疫相关细胞的浸润水平之间的关系。结果显示，CD276与不同癌症的免疫细胞浸润密切相关（图4）。CD276的表达与免疫细胞的浸润密切相关，从而解释了患者生存率的差异。

2.5 GSEA结果

为了验证CD276在泛癌中的生物学功能，采用R语言对其进行了GSEA。结果表明CD276主要富集在抗原处理和递呈、细胞膜感应通路、免疫移植物抗宿主病、类似I型受体的信号传导途径等（图5）。

2.6 验证CD276在泛癌中的表达

分别使用胃癌和结肠癌细胞对CD276在泛癌中的表达做了实时PCR检测mRNA验证。结果表明CD276在胃癌和结肠癌中均呈高表达（图6）。

图6 体外验证CD276的表达Fig.6 In vitro validation of CD276 expression

3 讨论

本研究探讨了CD276在泛癌中的表达、预后以及CD276与TME、TMB、MSI和免疫细胞浸润之间的关系。利用GSEA富集了CD276在泛癌中的相关通路，并对CD276在泛癌中的表达进行了体外实时PCR检测mRNA验证。

TME对免疫系统识别和介导自发性恶性肿瘤有很大影响。本研究结果显示，间质细胞或免疫细胞的数量随着CD276表达水平的提高而增加。CD276是一种与免疫有关的分子，能增强癌症的进展。研究［8］表明，CD276能阻断免疫细胞的抗肿瘤反应，促进细胞分化。Treg诱导白细胞介素-10的表达和CD276在树突状细胞（dendritic cell，DC）中的表达，这使得DC具有免疫抑制性。接触Treg后，DC使CD276上调，MHC肽复合物的数量减少，导致T细胞刺激受损。因此，CD276在介导T细胞对DC的抑制起着关键作用。CD276对αβ T细胞和Vδ2 T细胞都有抑制作用，但其调节机制仍不清楚。CD276上调TAMs促进肿瘤M2极化和CAFs的侵袭和迁移。此外，CD276还与PI3K/AKT、NF-KB、Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK2/STAT3和葡萄糖代谢信号通路有关［8］。

CD276是一个免疫家族相关的基因，其在免疫方面具有重要的作用。利用CIBERSORT算法研究了CD276表达与22种免疫相关细胞的浸润水平之间的关系［9］。结果显示，CD276参与了22种免疫相关细胞在各种癌症中的表达，其进一步说明了CD276在免疫方面对癌症的进展有重要影响。梁嘉瑜等［10］发现免疫检查点因子CD276是肾上腺皮质癌的个体预后和潜在治疗目标。CD276嵌合抗原受体T细胞可以成为治疗某些致命性或难治性小儿恶性肿瘤患者的治疗选择［11］。CD276广泛存在于各个系统的肿瘤中，在所有阶段的尿路内皮癌细胞中都明显升高。CD276在正常尿路内皮细胞中的表达减少可能意味着这些细胞将受到CD276介导的免疫疗法的保护［12］。

虽然本研究对于CD276的泛癌研究结合了多个数据库中的信息，但仍具有局限性。本研究仍停留在理论层面上，且得到的分析结果可能存在系统误差，仍需通过研究进一步验证。

综上所述，本研究结果显示，CD276的表达水平与多种肿瘤的预后有关，且与肿瘤中不同程度的免疫浸润有关，进一步揭示了CD276作为肿瘤免疫治疗靶点生物标志物的潜力。