亚洲玉米螟对球孢白僵菌分生孢子和芽生孢子-玉米共生体的取食选择和嗅觉反应

隋 丽, 路 杨, 谢 敏, 邹晓威, 李启云,,3,*, 张正坤,*

(1. 吉林省农业科学院植物保护研究所, 吉林省农业微生物重点实验室, 农业农村部东北作物有害生物综合治理重点实验室,公主岭 136100; 2. 吉林农业大学农学院, 长春 130118; 3. 吉林农业科技学院, 吉林 132101)

昆虫的取食行为是生理代谢中的第一个环节,是指昆虫摄取食物以及与此相关的一系列活动(Bernays, 1998)。一般同种昆虫个体的取食行为主要受两个因素的影响:营养需求和食物适合度(Dusetal., 2011)。昆虫借视觉、嗅觉、味觉等感觉通道对植物及环境所产生的刺激进行编码内导,最后通过神经中枢的综合和解码,并根据遗传所形成的模板和生理形态,对植物做出选择(彩万志等, 2001)。植物气味在植食性昆虫和天敌的生境定位、寄生或捕食行为中发挥着关键的作用,寄主植物的气味是植食性昆虫确定寄主身份的主要感官刺激物,能够对植食性昆虫的寄主搜索、取食和产卵行为产生影响(Bruceetal., 2005; Turlings and Erb, 2018)。例如,李俊龙等(2019)研究表明,棉花挥发物中两种化合物对红火蚁Solenopsisinvicta具有显著的引诱作用,是红火蚁定位棉蚜Aphisgossypii、建立共生关系中的关键因素;张萌萌等(2021)研究发现,桃树挥发物中的反-3-己烯醇和顺-3-己烯醇对东方绢金龟Sericaorientalis雌成虫有显著的吸引作用,能够为植物源引诱剂的开发奠定基础。因此,研究昆虫的选择性行为对于明确植物-昆虫互作关系,二者的生态适应性和害虫防治方面有着重要意义。

昆虫必须通过采食植物或其他动物所产生的有机物以取得生命活动过程所需要的能源,同时能够利用高度敏感的嗅觉系统用以检测并定位赖以生存的寄主(Bruce and Pickett, 2011)。植物作为自然生态系统中重要的生物类群,与周围环境变化有着密切的联系,也和同一生态系统中的其他生物(如微生物、昆虫)的存在紧密的相关性(Shikanoetal., 2017)。现有研究表明,很多有益微生物能够对寄主植物的表型和生理生化指标产生重要影响,例如丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)、外生菌根真菌(ectomy corrhizal fungi, ECM)和内生真菌等(Compantetal., 2010)。在植物与微生物协同进化的过程中,有益微生物能够促进寄主植物产生有利于保护自己或有利于寄主植物种群扩散的一系列性状,以调控昆虫的个体行为,这些性状包括植物的颜色、形状、大小等物理特性(王政等, 2014),同时也会产生多种不同的挥发性物质,以及一些次生代谢产物,对前来取食的昆虫产生驱避或拒食作用(Zhuetal., 2023)。可见,微生物能够通过对寄主植物性状的调控,进而影响植食性昆虫的行为,这种作用对于农业生态系统中合理利用种间关系开展绿色防控具有重要指导意义。

虫生真菌作为昆虫的病原性天敌,在防治农业、林业和卫生害虫领域发挥了巨大作用(Pedrinietal., 2007; Vega, 2009; Zhaoetal., 2023)。近年来,国内外有大量研究表明,球孢白僵菌Beauveriabassiana可以在自然状态或人工接种条件下定殖在植物组织内,对植物生长发育、抗性和耐逆性产生一系列影响(Vega, 2018; Mantzoukasetal., 2022)。此外,球孢白僵菌在植物内定殖,还能够对植食性昆虫产生一定的驱避性(隋丽等, 2020),并引起昆虫取食量降低,种群数量下降(Rasooletal., 2021)。然而,大部分研究关注的是球孢白僵菌分生孢子在植物中的定殖特性。本团队前期研究发现,球孢白僵菌不同类型孢子均能在植物中定殖且能提高寄主植物抗性(Suietal., 2022),但关于球孢白僵菌其他类型孢子在植物内定殖、间接调控昆虫的研究仍然欠缺。为明确球孢白僵菌分生孢子和芽生孢子定殖玉米对亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis个体行为的影响,本研究测试了亚洲玉米螟响应这两种孢子类型球孢白僵菌-玉米共生体的取食选择和嗅觉反应,旨在揭示不同类型球孢白僵菌在玉米-亚洲玉米螟互作过程中的调控作用,以期为合理利用种间关系开发高效、环保的生物防治产品提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试虫源为孵化后不超过12 h的亚洲玉米螟初孵幼虫,以及用人工饲料饲养的蜕皮后不超过24 h的3龄幼虫。供试幼虫为吉林省农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 供试植物

本研究选取玉米品种为垦粘一号,播种花盆规格为直径20 cm×高14.5 cm,土壤选用丹麦进口泥炭土,每盆装土2 kg,根据玉米幼苗生长的需求定时定量浇水。

1.3 供试菌种

球孢白僵菌菌株BbOFDH1-5由本实验室于2008年从吉林省德惠市采集的亚洲玉米螟僵虫虫体上分离得到。该菌株保藏在中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC No.32726)。本实验选取实验室培养的分生孢子和芽生孢子开展实验(Suietal., 2022)。

1.4 球孢白僵菌-玉米共生体构建

玉米生长至3～5叶期,采用灌根法构建球孢白僵菌-玉米共生体(隋丽等, 2020)。每整株玉米接种球孢白僵菌孢子悬液20 mL,孢子悬液浓度为1.0×108个孢子/mL,每隔24 h灌根1次,共灌根3次,第3次灌根24 h后取样。玉米幼苗共分为3组处理,分别为:处理1:对照组,以0.05% Tween-80代替球孢白僵菌孢子悬液;处理2:球孢白僵菌分生孢子(aerial conidia, AC)处理组;处理3:球孢白僵菌芽生孢子(blastospore, BS)处理组。

1.5 亚洲玉米螟取食选择性和非选择性试验

采用叶碟法(隋丽等, 2020)测定亚洲玉米螟初孵和3龄幼虫对1.4节构建的AC和BS处理组球孢白僵菌-玉米共生体取食选择率(图1)。

图1 叶碟法测定亚洲玉米螟初孵幼虫和3龄幼虫在非选择性(A)和选择性(B)条件下对球孢白僵菌-玉米共生体玉米叶片的取食选择率

1.5.1非选择性试验:选取直径为15 cm塑料培养皿,放置1张直径14 cm滤纸于培养皿底部, 加2 mL 蒸馏水保持滤纸湿润,每个培养皿沿四周等距离分别放置9片1 cm×1 cm的1.4节构建的对照组、AC处理组和BS处理组玉米新鲜叶片,在培养皿中心接入9头亚洲玉米螟初孵幼虫或3龄幼虫(3龄幼虫以人工饲料饲喂,试验前做2 h的饥饿处理)(图1: A),初孵幼虫和3龄幼虫分别重复10次。接虫后立即将培养皿用遮光布覆盖,移入(26±1) ℃、相对湿度(60±10)%、光周期14L∶10D的养虫室,分别在接虫后1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10和12 h时统计幼虫所在位置(叶片、培养皿壁或滤纸)及幼虫数量,计算幼虫取食选择率,分析亚洲玉米螟幼虫在不同处理组中,取食行为的变化情况。取食选择率(%)=(取食该处理组植物叶片的幼虫数/幼虫总数)×100。

1.5.2选择性试验:将一张直径14 cm滤纸铺在培养皿底部中央并浸润,等距离交替放置1.4节构建的对照组、AC处理组和BS处理组1 cm×1 cm分生玉米叶片,共6片(图1: B),试验设20次重复。其余处理及调查方法同1.5.1节,分析不同处理玉米叶片对亚洲玉米螟幼虫取食行为的影响。

1.6 亚洲玉米螟嗅觉选择试验

利用Y型嗅觉仪(XLM3-30-300XLM3-30-150,南京雪莱生物科技有限公司)测定亚洲玉米螟初孵幼虫和3龄幼虫对不同孢子类型球孢白僵菌-玉米共生体的嗅觉选择性(图2)。测试前,用75%的无水乙醇和正己烷对嗅觉仪管道、中央活动室和味源瓶进行冲洗,检查装置的气密性,确保转子流量计气体流速稳定,然后打开抽气泵,通气5 min使气体挥发,保持内部空气无污染。选取1.4节构建的对照组、AC处理组和BS处理组长势一致、叶面积大致相同、无病害、无害虫的玉米叶片,剪成面积为1 cm×1 cm的小叶片。实验时将等重量的玉米叶片放置在样品装载器位置,三臂分别放入对照组、AC处理组和BS处理组的玉米新鲜叶片。打开中央活动室的顶盖,将亚洲玉米螟初孵幼虫或3龄幼虫(3龄幼虫以人工饲料饲喂,实验前做2 h的饥饿处理)从中央端口引入,然后盖上顶盖,打开气泵,气体流速控制在300 mL/min,通气3 min,使气味充满Y型管道。当幼虫在越过某臂2/3处判定该试虫对该侧气味源作出选择。计时20 min未做出选择,记录为0(不计数)。每组20头幼虫,重复10次。每组完成后,用乙醇和正己烷清洗中央活动室,并随机交换3个处理位置,以免产生位置效应。其中,嗅觉选择系数大于0,表示试虫对味源物质有趋性,数值越大、趋性越强,最大值为1;嗅觉选择系数小于0,则表示试虫对味源物质有负趋性。嗅觉选择系数=(味源管中虫数-对照管中虫数)/总的反应昆虫的数量;嗅觉选择反应率(%)=(味源管中虫数/总的测试昆虫数量)×100。

图2 本研究使用的Y型嗅觉仪

1.7 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 25软件进行描述性统计及方差齐性检测,并通过Duncan氏新复极差法进行多重比较及显著性差异分析,运用LSD法进行多重比较分析,利用GraphPad 8.0.2软件做图。

2 结果

2.1 不同类型球孢白僵菌-玉米共生体对亚洲玉米螟取食选择的影响

在非选择性条件下,亚洲玉米螟初孵幼虫对分生孢子(AC)处理组和芽生孢子(BS)处理组玉米叶片的取食选择率与对照组玉米叶片的取食选择率差异显著(图3: A),接虫后3～12 h时初孵幼虫对BS处理组玉米叶片的取食选择率显著低于对对照组的取食选择率(P<0.05),接虫后4～12 h时初孵幼虫对AC处理组玉米叶片的取食选择率显著低于对对照组的取食选择率(P<0.05),3～5 h时初孵幼虫对BS处理组玉米叶片的取食选择率显著低于对AC处理组的取食选择率(P<0.05)。3龄幼虫对AC和BS处理组玉米叶片的取食选择率总体低于对对照组的取食选择率(图3: B),其中接虫后3～5 h时3龄幼虫对BS处理组玉米叶片的取食率显著低于对照组的(P<0.05),6～7 h时3龄幼虫对AC和BS处理组玉米叶片的取食选择率差异不显著,8～10 h时 3龄幼虫对AC和BS处理组中玉米叶片的取食选择率显著低于对照组(P<0.05);接虫后1, 2, 3, 5, 6, 7, 8和12 h时3龄幼虫对AC和BS处理组间玉米叶片的取食选择率差异不显著。

图3 非选择性条件下亚洲玉米螟初孵幼虫(A)和3龄幼虫(B)对球孢白僵菌-玉米共生体及对照组玉米叶片的取食选择率

在选择性条件下,亚洲玉米螟初孵幼虫对分生孢子(AC)处理组和芽生孢子(BS)处理组玉米叶片的取食选择率与对对照组玉米叶片的取食选择率差异显著(图3: A),接虫1～12 h时初孵幼虫对AC和BS处理组玉米叶片的取食选择率均显著低于对对照组玉米叶片的取食选择率(P<0.05),且对BS处理组玉米叶片的取食选择率显著低于对AC处理组玉米叶片的取食选择率(P<0.05)。3龄幼虫对AC和BS处理组玉米叶片的取食选择率总体低于对对照组玉米叶片的取食选择率,随着接虫时间的延长各组取食选择率均呈现上升趋势(图3: B);3龄幼虫对AC和BS处理组间玉米叶片取食选择率差异不显著(P>0.05)。

2.2 不同类型球孢白僵菌-玉米共生体对亚洲玉米螟初孵幼虫和3龄幼虫嗅觉反应的影响

亚洲玉米螟初孵幼虫对分生孢子(AC)处理组和芽生孢子(BS)处理组与对对照组玉米叶片的嗅觉选择系数和选择反应率存在显著差异(图5)。初孵幼虫对于对照组玉米叶片的嗅觉选择系数为0.2599,对AC和BS处理组玉米叶片的嗅觉选择系数分别为-0.6155和-0.4676(图5: A),对AC和BS处理组玉米叶片的选择反应率显著低于对对照组玉米叶片的(P<0.01),分别降低69.5%和71.2%,对AC和BS处理组之间玉米叶片选择反应率差异不显著(P>0.05)(图5: B)。

图5 Y型嗅觉仪检测亚洲玉米螟初孵幼虫对球孢白僵菌-玉米共生体及对照组玉米叶片的嗅觉选择系数(A)和嗅觉选择反应率(B)

亚洲玉米螟3龄幼虫对分生孢子(AC)处理组和芽生孢子(BS)处理组与对对照组玉米叶片的嗅觉选择系数和选择反应率存在显著差异(图6),3龄幼虫对于对照组玉米叶片的嗅觉选择系数为0.2113,表明对照组气味源物质对于亚洲玉米螟3龄幼虫有趋性;对于AC和BS处理组玉米叶片的嗅觉选择系数分别为-0.5950和-0.6170(图6: A),表明玉米螟3龄幼虫对于AC处理组和BS处理组气味源物质有负趋性。3龄幼虫对AC和BS处理组玉米叶片的选择反应率显著低于对对照组玉米叶片的(P<0.01),分别降低66.5%和68.3%,对AC和BS处理组之间的选择反应率差异不显著(P>0.05)(图6: B)。

图6 Y型嗅觉仪检测亚洲玉米螟3龄幼虫对球孢白僵菌-玉米共生体及对照组玉米叶片的嗅觉选择系数(A)和嗅觉选择反应率(B)

3 讨论

虫生真菌的植物内生性已经得到国内外研究者的广泛关注。近年来有一系列研究表明,虫生真菌在植物中定殖能够减少植食性昆虫对植株的危害,并间接对昆虫的生长发育产生不利影响,包括抑制昆虫生长、延长发育时期、降低存活率等(Mantzoukas and Grammatikopoulos, 2020; 秦华伟等, 2021)。本团队前期研究表明,球孢白僵菌不同类型孢子定殖能够提高植物抗病性(Suietal., 2022),本研究结果表明,不同类型球孢白僵菌孢子在玉米植株中定殖,能够对亚洲玉米螟取食行为和嗅觉反应产生显著影响,提高植物抗虫性,提示球孢白僵菌内生定殖在生物防治领域具有应用潜力。

本研究发现,在亚洲玉米螟取食选择和非选择条件下,初孵幼虫和3龄幼虫在未接种球孢白僵菌叶片对照组中的选择率均高于接种球孢白僵菌处理组(图3, 4),该结果与本团队前期研究结果(隋丽等, 2020)相似,即球孢白僵菌在植物中定殖能够减少植食性昆虫的侵食。Russo等(2019)的昆虫选择性试验也表明,玉米螟幼虫对球孢白僵菌内生定殖玉米叶片的消耗量较少;还有研究利用昆虫选择性试验明确了虫生真菌定殖植物对不同种类昆虫[例如,蚜科昆虫(Aphididae),玉米叶蛾Helicoverpazea]取食行为的驱避作用。现有研究结果证明,球孢白僵菌-玉米共生体能够通过减少昆虫采食量,对昆虫产生负效应,从虫生真菌定殖植物影响昆虫取食行为的角度解析了虫生真菌对植食性昆虫的间接调控作用。影响昆虫取食植物最主要的是植物的化学成分,其次是形态和结构(钦俊德, 1987)。Behie等(2017)的研究发现,虫生真菌在植物中定殖能够增加植株内氮元素以及一些微量元素的含量;还有研究发现虫生真菌定殖能够提高寄主植物对养分的利用率(Shrivastava, 2015; Quesada-Moraga, 2020)。我们推测,植物组织内养分含量的变化是影响昆虫取食行为的主要原因。此外,植物次生代谢物和超氧化物的产生、植物甾醇谱的变化以及间接系统反应的诱导也可能是引起昆虫行为改变的关键因素(Castillo Lopez and Sword, 2015),但关于这些方面的研究较少,在后续研究中仍有待于验证。

植物挥发物的组成成分与比例构成了植物具有种属特异性的“化学气味指纹谱”,这与昆虫定位取食植物有很大相关性(钦俊德,1995)。植物挥发性物质的化学组分及释放易随着季节、植物的年龄、生理状况、空间分布及环境因子(如光照、土壤等)的不同而发生组分的改变(李建光, 2001),同时植物受到机械损伤、害虫侵害、病原微生物及邻近植物诱导等也会影响挥发性物质的释放和组分变化,进而起到化学防御作用,这正是植物与环境协同进化的结果(Hartmann, 1996; Sharifietal., 2018)。本研究通过Y型管实验分析明确了球孢白僵菌定殖玉米对亚洲玉米螟幼虫嗅觉反应的影响,结果表明球孢白僵菌芽生孢子和分生孢子定殖叶片对亚洲玉米螟幼虫均具有负趋性(图5, 6)。鉴于挥发物是形成植物气味的主体,我们推测球孢白僵菌定殖改变了寄主植物挥发物的组成,进而引起昆虫的嗅觉反应发生改变。Zhu等(2023)的研究也证明了这一结论,该研究发现,球孢白僵菌在玉米中定殖,能够通过改变玉米植株挥发物成分,影响亚洲玉米螟的产卵行为,明确了虫生真菌能够通过调节植物挥发物组成,提升植物防御性能,诱导植物-昆虫之间的互作关系发生变化。本团队在前期研究中发现,球孢白僵菌定殖能够增加植物防御酶活性(Suietal., 2020),本研究则证明了球孢白僵菌定殖能够引起昆虫嗅觉反应发生改变,对植食性昆虫产生驱避作用,从而提高植物抗虫性。

综上所述,球孢白僵菌芽生孢子和分生孢子在玉米植株中定殖均能对亚洲玉米螟的取食行为和嗅觉反应产生负效应,说明球孢白僵菌能够通过调控昆虫的个体行为,对寄主植物起到保护作用。本研究进一步明确了虫生真菌-植物-昆虫三者之间的生态适应性,为开发安全、高效的生防微生物制剂奠定了基础,同时能够为农田生态系统中绿色防控技术提供技术支持。