南沙参总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究

杨丽华,刘子璇,徐香琴

(湖南科技学院 化学与生物工程学院,湖南 永州 425199)

南沙参又名沙参,具有养阴清肺、化痰、益气等功效,主要用于肺热燥咳、阴虚劳嗽、干咳痰黏、气阴不足、烦热口干等疾病的治疗[1]。研究发现,南沙参化学成分复杂多样,如多糖、酚酸、黄酮等[2-5]。但国内外以研究提取多糖类成分为主,对其黄酮类化合物的提取研究较少[6-8]。文献调研发现,目前常用的黄酮类化合物的提取方法主要有超声波辅助提取、微波提取、浸提法以及酶提法等[9-14],其中超声波辅助提取具有提取溶剂量少、提取率高且产物不受高温分解等优势而被广泛应用。此次研究以南沙参为原料,使用超声波辅助方法提取南沙参总黄酮,考察料液比、超声功率、乙醇浓度、超声时间对总黄酮提取率的影响,并探索总黄酮提取液进行体外清除DPPH自由基和ABTS+自由基抗氧化活性研究,以期为南沙参的深度开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南沙参:采购于亳州市腾飞中药材有限公司;芦丁(GR):上海蓝季生物有限公司;DPPH试剂:飞净生物科技有限公司;L(+)-抗坏血酸:国药集团化学试剂有限公司;ABTS+试剂:酷尔化学科技有限公司;亚硝酸钠;天津市恒兴化学试剂制造有限公司;氢氧化钠:天津市福晨化学试剂厂;硝酸铝:天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇:天津市致远化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SL-200型中药万能粉碎机:江阴市丰华药化机械有限公司;SHB - 111 型循环水真空抽滤泵:予华仪器有限责任公司; TE1200型电子天平:上海一恒科学仪器有限公司;ZF-1 型紫外分光光度计:赛默飞世尔科技公司;KQ3200DE型数控超声波清洗机:昆山市超声仪器有限公司,101-2A型电热鼓风干燥箱:天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制及含量测定

南沙参总黄酮的含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法进行[15]。精密称取经105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品26.3 mg(实含芦丁 25 mg),置25 mL容量瓶中,加乙醇溶解并定容至刻度,摇匀,精密移取20 mL至100 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液,分别量取上述对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL,分别置25 mL容量瓶中,分别加6 mL去离子水,摇匀,加5%亚硝酸钠溶液1 mL,混匀,静置6 min,加10%硝酸铝溶液1 mL,混匀,静置6 min,加4%氢氧化钠溶液10 mL,加去离子水至刻度,摇匀,静置15 min,于510 nm处测定其吸光度值,以蒸馏水代替芦丁溶液为空白对照。以芦丁质量浓度X为横坐标,吸光度值Y为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程为:Y=11.879X+0.041 9,R2=0.999,得出芦丁溶液质量浓度在0.005～0.05 mg/mL范围内,线性关系良好。

南沙参总黄酮含量的测定:精密称取样品2 g,用70%乙醇20 mL超声(功率90 W)提取20 min,过滤样品,精密量取待测提取液2 mL至25 mL容量瓶中,按照对照品方法显色后,于510 nm处测定吸光度值,根据标准曲线方程计算提取液中南沙参总黄酮生物质量浓度。按照下述公式计算总黄酮提取率:

式中:R为南沙参总黄酮提取率,%;C为提取液质量浓度,g/mL;V为提取体积,mL;m为样品干质量,g。

1.3.2 体外抗氧化活性测定

参考孟晶晶等[16]的DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率测定方法。

1.3.3 单因素实验

分别考察提取时间(5,10,15,20 min),料液比(1∶5,1∶10,1∶15,1∶20)、乙醇浓度(30%,50%,70%,90%)、超声功率(60,90,120,150 W)对南沙参总黄酮提取率的影响。

1.3.4 正交试验设计

根据单因素的试验结果,进行正交试验的设计,对南沙参总黄酮的提取工艺进行优化。采用L9(34)正交表优化南沙参总黄酮提取工艺,其因素和水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平

1.3.5 数据分析

使用Excel 2010、spss21.0和Origin软件进行相关实验数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对南沙参总黄酮提取率的影响

从图1可以看出,提取时间在5～10 min,总黄酮提取率变化较少,10～15 min,南沙参总黄酮提取率随着超声时间的增加而增大可能是因为超声时间较短时,南沙参总黄酮来不及完全溶出,从而导致提取率较低,当超声时间超过15 min以后,可能是提取时间较长时,使得南沙参黄酮类物质会发生氧化而使得结构被破坏,从而使得南沙参总黄酮萼提取率下降。确定超声时间15 min为最佳。

图1 提取时间对南沙参总黄酮提取率的影响

2.1.2 料液比对南沙参总黄酮提取率的影响

由图2可知,料液比1∶5(g∶mL)～1∶10(g∶mL)变化时,南沙参总黄酮提取率随着料液比的增加而增大,可能是当料液比较小时,提取溶剂无法浸润南沙参药材,从而导致南沙参总黄酮的溶出受阻,当料液比超过1∶10(g∶mL)时,可能是溶剂过多,从而导致过滤等步骤中南沙参总黄酮的损失,从而导致南沙参总黄酮的提取率下降。确定料液比1∶10(g∶mL)为最佳。

图2 不同料液比对南沙参总黄酮提取率的影响

2.1.3 乙醇浓度对南沙参总黄酮提取率的影响

由图3可知,乙醇浓度在30%～70%时,南沙参总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加而呈现增大趋势,可能是当乙醇浓度较小时,提取溶剂的极性比较大,导致南沙参总黄酮的溶出率较低。而当乙醇浓度超过70%时,乙醇的浓度较高时,大量脂溶性化学成分和醇溶性化学成分与南沙参总黄酮竞相溶出,从而使得南沙参总黄酮的提取率下降,因此确定70%乙醇为最佳乙醇浓度。

图3 不同乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.1.4 不同提取功率对南沙参总黄酮百分含量的影响

由图4可知,当超声功率由60～120 W变化时,南沙参总黄酮提取率随着超声功率的增加而增大,可能是超声功率较低时,南沙参总黄酮类化学成分渗透、扩散和溶解能力较低,从而导致南沙参总黄酮的提取率较小。当超声功率超过120 W时,超声功率过大可能会使得南沙参总黄酮中的不稳定化学成分的结构发生改变,从而使得南沙参总黄酮的提取率下降。因此确定120 W为最佳功率。

图4 不同提取功率对黄酮提取率的影响

2.2 正交法优化南沙参总黄酮提取工艺

表2为L9(34)正交实验的结果。根据表1数据分析,从R值分析乙醇浓度(C)>料液比(B)>超声功率(D)>超声时间(A)。根据K值得出提取的最佳工艺是:A3B3C3D2。即提取时间为20 min,料液比为1∶15(g∶mL),乙醇浓度90%,提取功率为120 W,此时,南沙参总黄酮提取率量为0.46%,提取条件稳定性实验表明RSD值为0.35%,说明此工艺稳定。

表2 正交试验设计与结果

2.3 南沙参总黄酮抗氧化性活性试验抗氧结果

2.3.1 南沙参总黄酮不同浓度对DPPH·自由基的清除能力

DPPH·自由基是一种较稳定的自由基,当加入样品后,若含有抗氧化物质提供电子与DPPH·自由基配对使其颜色变浅,通过褪色程度就可以衡量清除活性的大小。由图5可知,随着南沙参总黄酮和维生素C浓度增加,DPPH自由基的清除率逐步增大,说明南沙参总黄酮和维生素C对DPPH自由基的清除能力呈现剂量依赖关系。当质量浓度达到0.009 5 mg/mL时,维生素C对照液对DPPH自由基的清除率高达97.4%,南沙参总黄酮对DPPH自由基清除能力为38%,说明其对DPPH自由基的清除能力较差。

图5 不同浓度南沙参总黄酮对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 南沙参总黄酮不同浓度对ABTS+自由基的清除能力

不同浓度南沙参总黄酮对ABTS+自由基的清除能力见图6。

图6 不同浓度南沙参总黄酮对ABTS+自由基的清除能力

由图6可知,随着南沙参总黄酮和维生素C浓度的增加,对ABTS+自由基的清除率逐渐增大,说明南沙参总黄酮和维生素C的浓度与ABTS+自由基清除率之间呈现剂量依赖关系,且同一浓度下南沙参总黄酮对ABTS自由基的清除能力强于维生素C对照液。当南沙参总黄酮浓度和维生素C质量浓度达到0.007 9 mg/mL时,其清除率高达96.74%,说明南沙参总黄酮具有非常强的清除ABTS+自由基的能力。

3 结论

本研究以南沙参总黄酮的提取率为考察目标,在单因素实验考察基础上,采用正交设计,获得最佳提取工艺:即以90%的乙醇溶液作为提取溶剂,提取时间为20 min,料液比为1∶15(g∶mL),提取功率为120 W,此时总黄酮提取率为0.46%。采用最优工艺对南沙参总黄酮进行提取,并测定南沙参总黄酮对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别可达38%,96.74%,说明南沙参总黄酮对DPPH自由基的清除率弱,对ABTS自由基的清除率非常强,说明南沙参具有良好的抗氧化活性,是一种潜在的天然抗氧化剂,值得深入研究。