藏区白芥叶子提取分析及其作为天然化妆品原料的应用潜力

洛桑塔杰,张建峰,薛萍,华小懿,冯江江,杜立永

(1.西藏藏医药大学,西藏 拉萨 850000;2.无锡市药品安全检验检测中心,江苏 无锡 214122;3.江南大学,江苏 无锡 214122)

白芥(学名:SinapisalbaL.)是十字花科、白芥属植物。一年生草本,高达75(-100)cm;茎直立,有分枝。下部叶大头羽裂;叶柄长1～1.5 cm;上部叶卵形或长圆卵形。总状花序有多数花,果期长达30 cm;花淡黄色,直径约1 cm;花梗开展或稍外折;花瓣倒卵形,长8～10 mm。长角果近圆柱形,长2～4 cm,宽3～4 mm,直立或弯曲;种子每室1～4个,球形,直径约2 mm,黄棕色,有细窝穴,花果期6～8月[1-2],如图1所示。

图1 白芥图片

白芥作为一种中草药植物,被发掘研究的历史悠久。然而,现有对白芥的研究报道集中在白芥的种子,即白芥子。白芥以种子入药,含白芥子甙、芥子酶、芥子碱、4-羟基苯甲酰胆碱、4-羟基苯甲胺等成分,有温肺豁疾利气、散结通络止痛功能,用于寒疾喘咳、胸胁胀痛、痰滞、经络关节麻木、痰湿流注、阴疽肿毒等症[3-6]。

中草药提取物具有稳定、温和、安全、有效等特点。2023年2月28日,国务院办公厅发布中医药振兴发展重大工程实施方案。如何更加高效地利用具有药效的草本植物,挖掘其隐藏功能与价值成为研究热点。同样在化妆品领域,利用中医药特色,研发出针对性强、性能明显的活性天然植物原料,进而开发出美容护肤保养的天然护肤化妆品,正悄然引领全球化妆品潮流。以植物的不同部位入药,研究其功能,是中药领域常用手段。相同植物在不同环境下生长,其各部位成分有所差异,导致其药效亦有所不同。少数民族医药因地理位置,独特的民族文化等因素有其专属的特色。其中,藏植物药更是中华民族中医药不可或缺的组成部分,位于中国四大少数民族——藏、蒙、维、傣族医药之首。相比于普通的草本植物,藏植物药具备活性高、营养成分高、低污染以及药力充沛等特点,在抗氧化、抗衰老、防腐及抗炎等诸多方面的功效突出[7]。

此外,黄酮类与酚类物质广泛存在于天然植物中。众多研究表明,这两类物质具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等生物活性[8-9]。此外,植物源多糖广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等器官中,其主要生理功能包括保湿、抗氧化、抗衰老、增强免疫、防晒、皮肤组织修复、促进皮肤血液循环、抗痤疮等作用,可用于化妆品中起到改善皮肤环境、美肤护肤的效果[10]。

综上,本工作选取藏区白芥作为研究媒介,首次对白芥叶子部位进行提取分析研究,以充分发掘白芥的应用价值。通过水与75%乙醇提取对比,对白芥叶子提取物中多糖、黄酮、酚类成分进行含量测定与质谱分析,并最终对提取物进行功效评价测试,以初步确认白芥叶子提取物应用于化妆品的潜力。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙醇、硫酸(95.0%～98.0%)、苯酚(≥99.0%)、无水亚硫酸钠(≥97.0%)、九水硝酸铝(≥99.0%)、亚硝酸钠(≥99.0%)、氢氧化钠(≥96.0%)、福林酚试剂(1 mol/L)均购自国药集团,葡萄糖(≥97.0%)购自上海浩鸿生物医药科技有限公司,没食子酸(99%)购自北京伊诺凯科技有限公司,维生素C(99.0%)、地塞米松(≥99%)购自源叶生物,透明质酸酶、透明质酸、十六烷三甲基溴化铵(CTAB)均购自麦克林,醋酸钠缓冲溶液(广州化学试剂厂)、高效液相色谱-四级杆静电轨道肼质谱联用仪(Thermo,UHPLC-MS-Q Exactive) 色谱柱为:ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD 2.1×100 mm,1.8 μm。

1.2 方法

1.2.1 去离子水/75%乙醇提取

取藏区白芥叶子晒干并研磨成粉[0.300 mm(50目)],选用去离子水以及75%乙醇分别作为提取溶剂,料液比(g∶mL,下同)1∶10,1∶20,1∶30的条件下对其进行回流提取4 h,过滤后在45 ℃烘箱烘干。

1.2.2 总黄酮、多糖、酚含量的测定

参照GB/T 20574—2006进行白芥叶子提取物总黄酮含量的测定;参照DB45/T 2143—2020 进行多糖含量测定;参照T/GZCX 020—2022进行总酚含量的测定。

1.2.3 提取物成分分析

0.1 g提取物溶于100 mL去离子水中,超声60 min,然后在室温下以10 000 r/min离心10 min,取上清液注入HPLC-MS系统。

采用梯度洗脱法进行液相分析,流动相为超纯水与甲醇,梯度设置如表1所示。

表1 高效液相梯度参数

1.2.4 体外保湿功效评价

吸取500 μL样品,加入500 μL超纯水,混匀,配制成体积分数为50%的样品溶液,随后进行1∶1稀释,混匀,共五个浓度。称取维生素C(对照组)0.100 0 g,加入醋酸钠缓冲溶液1 mL,配制成质量浓度为100 mg/mL,随后1∶1逐级进行稀释,共5个浓度。

采用CALT/TM/SOP282-01体外透明质酸酶抑制试验标准操作规程,进行保湿功效评估。

空白组:1.5 mL EP管中依次加入透明质酸50 μL,醋酸钠缓冲溶液300 μL;

反应组:1.5 mL EP管中依次加入透明质酸50 μL,醋酸钠缓冲溶液150 μL,透明质酸酶200 μL;

阳性对照组:1.5 mL EP管中依次加入透明质酸50 μL,醋酸钠缓冲溶液50 μL,透明质酸酶200 μL,维生素C 100 μL;

样品组:1.5 mL EP管中依次加入透明质酸50 μL,醋酸钠缓冲溶液50 μL,透明质酸酶200 μL,测试样品100 μL;

各组在(37±1) ℃下反应150 min,反应结束后,加入CTAB溶液500 μL,在(37±1) ℃下孵育3 min,取200 μL至96孔板,使用酶标仪(CALT/2017E004)在400 nm波长下测定吸光度值。

按下面公式计算抑制率:

使用GraphPrism进行拟合,计算IC50,即抑制率为50%时测试样品的浓度。

1.2.5 体外舒缓功效评价[11-13]

将0.5 mL FBS(胎牛血清)加入49.5 mL MEM培养基中,配制成含1%FBS的MEM培养基,作为空白组(NC)。称取样品0.200 mL,加入0.800 mL 1% FBSMEM培养基,配成体积分数为20%的储备液,再依次稀释至体积分数0.20%,0.10%,0.05%,共3个浓度。称取一定量的地塞米松(阳性对照组PC),加入甲醇溶解,配制成地塞米松储备液,再使用维持培养液稀释为工作浓度。试验分组见表2。

表2 试验分组

采用CALT/TM/SOP270-01角质细胞抗刺激试验标准操作规程进行体外舒缓功效评价。

细胞系:人角质细胞(HaCaT),来源于上海晶抗生物工程有限公司,代数:32;完全培养液:含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基(FBS,Lot:2500251P);维持培养液:含1% 胎牛血清的MEM培养基(FBS,Lot:2500251P);测试条件:培养箱温度(37±1) ℃,湿度90%±5%,CO25%±1%;MTT溶液:用PBS将MTT配制成质量浓度为5 mg/mL的MTT储备液,使用0.22 μm的针头滤器过滤除菌,-20 ℃保存(Lot:20230209)。

1)细胞毒性筛查:将培养的细胞接种于96孔板中,置于培养箱中培养18～24 h至细胞80%融合。去除原培养液,每孔加入一定量不同浓度样品稀释液,在培养箱中暴露(72±1) h。取出培养板,弃去孔中原液体,每孔加入100 μL 1%FBS的MEM培养基。每孔中加入20 μL MTT溶液,在37 ℃下孵育(3±0.5) h。然后去除MTT溶液,各孔中加入100 μL DMSO,避光振荡10～15 min后在570 nm波长下测定吸光度值。

2)角质细胞抗SDS刺激测试:制备一定密度的细胞悬液,将细胞悬液接种于96孔细胞培养板,培养18～24 h。取出培养板,弃去孔中原培养液,除空白对照组外,每孔加入一定量含SDS的维持培养液,空白对照组加入一定量维持培养液,返回培养箱孵育30 min。取出培养板,弃去孔中原培养液,每孔加入一定量PBS清洗1次,然后,空白对照组、模型组每孔加入一定量维持培养液,其余各组加入含样本或阳性对照的维持培养液,返回培养箱孵育(24±1) h。然后每孔加入一定量含MTT的维持培养液,培养箱孵育3～4 h。去除孔中液体,每孔加入100 μL DMSO,置于振荡器振荡10～15 min后,在酶标仪570 nm波长处测定吸光度。

数据采用SPSS进行分析,并以均值±标准差表示,如果p<0.05考虑差异具有统计学意义。

细胞活性以空白对照组(Control)细胞活性为100%,计算各组相对细胞活性(Viability),计算公式如下:

2 结果与讨论

如前文所述,现有关于白芥植物的研究,主要集中在其种子(白芥子),而白芥叶子大多作为废弃物处置。为了充分拓宽白芥的应用潜能,使其价值最大化,本论文对白芥叶子进行了提取,并对提取物进行了黄酮、多糖、酚类物质总量的分析。如图2以及表3所示,白芥叶子中含有大量的多糖,同时含有一定的黄酮以及酚类物质,这些物质初步说明了其作为化妆品天然植物原料的可能。具体地,相对于75%乙醇作为提取溶剂,以水作为溶剂的白芥叶子提取物中总黄酮含量较高(最高可达48.45 mg/g,料液比1∶30),但是多糖和酚类物质的含量较低。醇提物中,多糖和酚类物质的含量相对较高,分别可高达654 mg/g(料液比1∶30)与64.7 mg/g(料液比1∶10)。

表3 白芥叶子提取物成分含量表

图2 组方1水/75%乙醇提取物的黄酮、多糖、酚含量分析

此外,现有报道显示白芥子的主要的活性物为芥子碱、芥子苷以及部分油脂等。同种植物不同部位包含的主要活性物质可能不尽相同。为了进一步分析白芥叶子中所含物质的种类,利用采用UHPLC-MS-Q Exactive法对1∶30料液比提取物成分进行分析,结果如图3与图4所示。

注:(1～22)为白芥叶子水提与75%醇提共同含有的物质,醇提图中不再重复列出。

图4 白芥叶子75%乙醇提取物的质谱分析

在白芥叶子水提取物(图3)中,主要存在的黄酮类物质有根皮素、桑黄素、槲皮素;主要存在的酚类物质可能为L-酪氨酸、对羟基苯甲醛、4-羟基-3-甲氧桂皮醛、4-羟基肉桂酸甲酯、7-羟基香豆素以及肉豆蔻木素。相对地,在白芥叶子醇提物(图4)中,黄酮类物质除了根皮素、桑黄素、槲皮素外种类有所增加,还包含三叶苷、圣草酚、染料木黄酮、柚皮素查尔酮;酚类物质种类也有所增加,包含大麦芽碱、7,8-二羟基-6-甲氧基香豆素、4-甲氧基水杨酸、3-羟基-4-甲氧基苯甲酸、2,4-二羟基-6-甲基苯甲酸、绿原酸、隐绿原酸、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸。

需要说明的是,质谱测试几乎没有检测出糖类物质,这可能是因为多糖类物质在本文采取的测试条件下比较难进行分辨。此外,除了本文关注的黄酮、酚类物质外,白芥叶子中还存在多种苷、生物碱、氨基酸类物质,这些天然成分也会赋予天然提取物更多的功效与应用性,可以作为后续进一步研究。

为了进一步考察白芥叶子提取物在化妆品中的应用潜力,本文进一步对1∶30料液比下白洁叶子水提取物进行体外保湿与舒缓的功效测试。

参与皮肤保湿的关键成分之一是透明质酸,其与天然保湿因子(NMF)、皮肤的天然脂质双分子层一起作用,促进和维持表皮和底层的保湿[11-14]。当皮肤障碍受损,会产生透明质酸酶,进一步使透明质酸分解。本文主要考察白芥叶子提取物对透明质酸酶的抑制作用。透明质酸与CTAB阳离子表面活性剂可发生络合反应,产生混浊现象,进而可以利用比色法检测样品对透明质酸酶的抑制结果,来评价其功效。如表4所示,白芥叶子水提取物在体积分数为50%时,对透明质酸酶的抑制率高达76%左右,随着浓度的降低,抑制效果降低。除此之外,经计算,阳性对照组IC50为54.44 mg/mL(95%Cl:51.96～57.04 mg/mL),而白芥叶子提取物IC50液均无法计算(极低)。而受试物IC50越小,受试物抑制透明质酸酶能力越强。这些结果均说明白芥叶子水提取物对透明质酸酶均有抑制作用,进而表明其具有一定保湿效果。

表4 白芥叶子水提取物的透明质酸酶抑制率

本文先采用SDS刺激 HaCaT角质细胞,然后将样品作用于刺激后的角质细胞,通过检测角质细胞的细胞活力的变化,评价样品的舒缓功效[15-17]。如表5与图5所示,在本文选取的方法下,模型组(M)与空白对照组(NC)相比,细胞活力明显降低(p<0.05);阳性对照组与模型组相比,细胞活力明显升高(p<0.05),表明造模成功。与模型组相比,白芥叶子水提取物(1∶30 提取液)在体积分数0.20%,0.10%,0.05%测试下细胞活力分别显著升高了19.51%,15.89%,6.05%。

表5 不同组别细胞活力差异比较(Mean±SD)

综上所述,白芥叶子提取物在本文实验条件下,具有较好的保湿与舒缓功效,具备作为保湿、舒缓功效天然化妆品原料的潜力。

3 结论

利用水与75%乙醇为溶剂对藏区白芥叶子进行了提取,并对其提取物中的黄酮、多糖以及酚类物质进行了测定,同时选取质谱测试对各提取物成分进行了分析。与现有白芥子的成分报道不同,本文中白芥叶子中富含黄酮、多糖以及酚类物质。采用1∶30料液比的水提物进行了保湿以及舒缓体外功效测试,结果表明白芥叶子水提取物(1∶30提取液)在体积分数为50%时,对透明质酸酶的抑制率高达76%左右;同时,在体积分数0.20%测试下HaCaT角质细胞活力可显著升高19.51%。这些结果表明,白芥叶子提取物具有作为保湿舒缓类天然化妆品原料的潜力。同时,本工作首次选取藏区白芥叶子作为研究对象,变废为宝,有利于藏药价值的最大化。