液液萃取-气质联用法分析不同陈酿时间朗姆酒香气成分

高俊杰，李志星，姚彬彬，赵先炎，胡文效*，邱磊*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院） 生物工程学院，山东 济南 250353；2.山东中烟工业有限责任公司技术中心，山东 济南 250014）

朗姆酒与中国白酒、白兰地、威士忌、伏特加和金酒齐名，是“世界六大蒸馏酒”之一[1-4]。朗姆酒最早起源于加勒比海地区的西印度群岛，即现在的古巴地区[5]，后传入欧洲，迄今已有200 年左右的生产历史[6]。朗姆酒是以甘蔗汁或甘蔗附属物如糖蜜等为原料，经酒精发酵、蒸馏、橡木桶陈酿等一系列工序后酿制而成，它因口感甜爽、芳香馥郁、果味突出，现已成为广大消费者喜爱的一种世界名酒[7]，在世界畅销的酒精饮料中销量仅次于白兰地和威士忌，排名第三[8]。我国朗姆酒市场十分广阔，近年来对朗姆酒的进口量逐年增加，跃居我国进口酒精饮品量之首[9]。

朗姆酒的香气主要取决于原料、发酵和陈酿这3 个方面[10]。由于原料类型、发酵条件和所用菌种以及陈酿时间的不同，朗姆酒中酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类等主要呈香物质的种类、含量及比例存在差异，进而造就了不同朗姆酒的香气特点，同时也决定了朗姆酒品质的高低。然而目前国际上对朗姆酒关键香气化合物的组成仍没有清晰定论，对朗姆酒的检测标准也仅局限于原料和主要成分规定上，对香气成分的检测标准也未做出明确规定，因此，根据其他酒类（如白兰地、白酒）香气成分的检测方法对朗姆酒中的香气组分进行定性和定量分析具有十分重要的研究价值和现实意义[7]。

气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术属于质谱分析学的一部分，因其可准确对产品中各种化合物进行定性和定量分析被广泛应用于食品指标检测、生物医药及化工涂料研发等领域[11]。酒类中酒精和水占绝大部分比重，香气成分所占比重甚微，而恰恰是这些微量的香味物质对酒体的风格和口感起着至关重要的作用[12-13]。为了便于利用GC-MS 对各种香气成分进行准确定性和定量，需要对酒样进行必要的前处理，从而将这些微量香味物质分离出来。常见的前处理方法包括液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）法[14-15]和顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）法[16-17]。为尽可能地将酒类中的不同挥发性和极性的香气物质提取完全，本研究以二氯甲烷为萃取剂，利用液液萃取法和气相色谱-质谱联用技术对哈瓦那俱乐部3 年、哈瓦那俱乐部7 年和哈瓦那俱乐部樽融3 种不同陈酿时间朗姆酒中的香气成分进行定性和定量分析[18]，探究3 种朗姆酒的香气组成，以期为我国高质量朗姆酒评价系统的建立和完善提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3 款朗姆酒[哈瓦那俱乐部3 年、哈瓦那俱乐部7年和哈瓦那俱乐部樽融（陈酿时间在25 年以上）]：保乐力加（中国）酒业有限公司；氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-辛醇标准品：上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷（色谱纯）：美国天地试剂公司。

1.2 仪器与设备

XS104 型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；液液萃取装置（500 mL 梨形分液漏斗及漏斗架）：山东力戈生物科技有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪：德国海道夫公司；DC-12 氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司；7890B/7000D 气相色谱-质谱联用仪、DB-5 非极性毛细管柱色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 朗姆酒酒样的前处理

取25 mL 朗姆酒于锥形瓶中，加入75 mL 去离子水将其稀释至酒精度为10% vol 左右[19]，加入2 g 氯化钠。将处理完的朗姆酒酒样转移至分液漏斗中，并用二氯甲烷先后萃取3 次（60、40、20 mL），静置后将下层有机相倒入锥形瓶中合并，加入干燥后的无水硫酸钠15 g，静置过夜。最后将有机相常压45 ℃下旋转蒸发、氮吹浓缩至1 mL，转移至1.5 mL 进样瓶中，加入20 μL 质量浓度为1 g/L 的2-辛醇标准品（内标），密封好并置于4 ℃冰箱中保存，进样时采用直接进样方式进样1 μL。

1.3.2 GC-MS 分析条件

GC 条件：DB-5 非极性毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm）；升温程序为50 ℃保持2 min，以4 ℃/min升温至170 ℃保持5 min，以8 ℃/min 升温至280 ℃保持10 min；载气（He）（99.99%）流速1.0 mL/min，压力53.5 kPa，采用分流比6：1 方式进样，进样体积1 μL。

MS 条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；检测器电压830 eV；传输管线温度280 ℃；进样口和接口温度为250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；全扫描模式（Scan）；质量扫描范围35～350 amu；扫描速度：769 amu/s；溶剂延迟4 min。

1.3.3 定性和定量方法

定性方法：根据NIST14 谱库对GC-MS 扫描分析得到的各香气化合物组分进行计算机检索，利用匹配度＞80%特征离子和保留时间进行定性分析。

定量方法[20]：采用半定量方法对各组分进行定量分析，按下列公式计算。

Xi=Ai/As×Cs

式中：Xi为待测物的质量浓度，g/L；Cs为内标物（2-辛醇）质量浓度，g/L；Ai为待测物的峰面积；As表示内标物的峰面积。

1.3.4 香气活力值的计算方法

香气活力值（odor activity value，OAV）可从阈值和浓度两个维度上评价某香气化合物对整体风味的贡献度，进而表征酒中的关键香气化合物。各化合物的OAV（W）可按下列公式计算[21]。

W=ρ/T

式中：W 为各化合物的OAV；ρ 为香气化合物在酒中的质量浓度，g/L；T 为香气化合物的香气阈值（以10%乙醇水溶液计），μg/L。

1.4 数据处理

数据统计及绘图均在Excel 2007 软件完成。

2 结果与分析

2.1 3 种朗姆酒的香气成分测定结果

采用LLE-GC-MS 法对3 种哈瓦那俱乐部朗姆酒中的香气成分进行测定，其GC-MS 分析的总离子流色谱图见图1，3 种朗姆酒中香气成分的测定结果见表1。

表1 3 种朗姆酒中香气成分的GC-MS 测定结果Table 1 Determination of aroma components in three types of rum by GC-MS

图1 3 种朗姆酒中香气成分GC-MS 分析的总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatograms of aroma components in three types of rum by GC-MS

由图1 和表1 可知，3 种朗姆酒中香气化合物的分离效果较好且种类和含量存在明显差异，从中共检测出139 种香气成分，包括47 种酯类、23 种醇类、15 种酸类、13 种醛类、16 种酮类、8 种酚类、17 种其他类，这与杨华峰等[22]对银朗姆酒不同蒸馏阶段香气物质的研究结果极为相似。检出的香气成分大多为中链香气化合物，占检出香气成分总数的82.01%。此外，检出的酯类中包括3 种内酯类，内酯类是朗姆酒陈酿过程中长时间与橡木桶作用产生的，其含量会随着陈酿时间的延长而有所增加，这里将内酯类单独作为一类香气成分进行讨论。

哈瓦那俱乐部3 年中共测得58 种香气化合物，包括酯类20 种（50.71%）、内酯类3 种（1.27%）、醇类9种（15.12%）、醛类6 种（10.10%）、酸类7 种（15.13%）、酮类3 种（0.85%）、酚类3 种（1.02%）和其他类7 种（5.81%）；哈瓦那俱乐部7 年中共测得65 种香气化合物，包括酯类24 种（31.54%）、内酯类2 种（1.74%）、醇类14 种（34.38%）、醛类6 种（15.70%）、酸类5 种（8.94%）、酮类5 种（5.04%）、酚类2 种（0.43%）和其他类6 种（5.62%）；哈瓦那俱乐部樽融中共测得102 种香气化合物，包括酯类33 种（30.23%）、内酯类2 种（1.91%）、醇类14 种（17.57%）、醛类11 种（31.85%）、酸类11 种（9.65%）、酮类12 种（2.74%）、酚类6 种（0.43%）和其他类12 种（5.62%）。3 种朗姆酒中检出的香气成分总量随着陈酿时间的延长而增大，哈瓦那俱乐部3 年、哈瓦那俱乐部7 年和哈瓦那俱乐部樽融中检出的香气成分总量分别为30.67、36.85 g/L 和73.81 g/L，哈瓦那俱乐部樽融中各类香气化合物的含量均高于其他2 种朗姆酒，这与陈酿过程中氧化还原作用和酯化反应产生的芳香物质的积累有关[23]。另外，陈酿时间较长的朗姆酒香气成分中内酯类和醛类的含量及其占比较大，这些成分多来自橡木。

2.2 3 种朗姆酒中的共有香气组分

为进一步探究朗姆酒普遍的香气特征，对3 种朗姆酒中的共有香气成分进行统计分析，结果见表2。

表2 3 种朗姆酒中的共有香气成分Table 2 Common aroma components in three types of rum

由表2 可知，3 种朗姆酒共检测出25 种共有香气成分，包括12 种酯类、1 种内酯类、3 种醇类、1 种酸类、3 种醛类、1 种酮类、1 种酚类和3 种其他类。这些共有香气成分的含量分别占3 种朗姆酒各自香气成分检出总量的76.67%、72.50%、56.33%，对朗姆酒总体香气成分影响较大，它们相互作用形成了朗姆酒果香、花香、甜香、木香、熏香的基础香气特征。

2.3 3 种朗姆酒中香气组分的OAV 分析

为进一步确定3 种朗姆酒中的特征香气组分，对3种朗姆酒中可查询到阈值的香气化合物进行OAV 计算，发现部分香气化合物的阈值较小，OAV 较大，因此，OAV 的计算结果取以10 为底数的对数后用OAV* 表示，OAV 值计算结果、相应的香气特征及分类情况见表3。OAV＞1 即OAV*＞0 时，说明该香气化合物对相应朗姆酒的香气类型有贡献且值越大，贡献就越大。

表3 3 种朗姆酒中香气成分的OAVTable 3 OAV of aroma components in three types of rum

由表3 可知，从3 种朗姆酒中检出且能查到阈值的香气化合物共有18 种，其中可被检出的化合物的OAV* 均大于0，说明这些化合物对朗姆酒的香气有贡献。现将OAV＞10 000 即OAV*＞4 的化合物定为第一梯度贡献最大的香气化合物，其组分包括大马士酮、辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯；第二梯度的贡献较大的香气化合物有香兰素、2-苯乙醇、愈创木酚、水杨酸甲酯、α-松油醇，其中可被检出的化合物的OAV*均介于3～4 之间；其他7 种香气化合物的OAV* 均小于3，被划分到贡献较小的第三梯度，这与Pino 等[25]对陈年朗姆酒中气味活性化合物的研究结果类似。结合表1 可知，3 种朗姆酒中酯类、醇类、醛类香气化合物含量较高且占比较大，这在一定程度上说明了香气化合物的含量大小决定了其对朗姆酒整体香气的贡献大小。此外，大马士酮的含量与愈创木酚相近，而OAV 却明显大于愈创木酚。因此，仅依据某香气化合物的含量来判断其贡献度大小是不准确的，还应考虑到该香气化合物的阈值大小。

2.4 感官评定

为进一步确定3 种朗姆酒中的风味活性物质，需将香气化合物和感官特征联系起来。3 种朗姆酒的感官评定结果见图2。

图2 3 种朗姆酒的香气轮廓图Fig.2 Aroma profiles of three types of rum

香气化合物的香气特征大致可归类为10 种香气类型：花香、果香、甜香、青香、奶香、熏香、木香、辛香、药香和脂蜡香，这些香气类型是人的感官对朗姆酒整体香气特征的评定，是多种香气成分之间相互作用（协同或掩盖）形成的[26]。在这些香气类型中，果香和花香是朗姆酒最突出的香气特点，是朗姆酒香气的主体部分，其次是甜香、青香和奶香，它们对朗姆酒的香气也具有较大影响。此外，虽然脂蜡香、熏香、木香、辛香和药香对朗姆酒的香气影响较小，但是它们与其他几种香气类型相互协调共同构成了朗姆酒的整体风味，其中熏香、辛香和药香随着朗姆酒陈酿时间的延长有明显增加的现象，这主要取决于陈酿过程中酚类和醛类物质的积累，其中酚类物质的存在也是朗姆酒抗氧化的主要原因。

3 讨论与结论

本研究利用LLE-GC-MS 法对3 种朗姆酒（哈瓦那俱乐部3 年、哈瓦那俱乐部7 年和哈瓦那俱乐部樽融）的香气成分进行了分离和分析。3 种朗姆酒共检测出139 种香气成分，包括酯类、醇类、酸类、醛类、内酯类、酮类、酚类、其他类8 类，其中酯类化合物的种类最多，有44 种。酯类是由朗姆酒发酵过程中的醇类和酸类发生酯化反应生成的，是酵母细胞在酒精发酵过程中产生的一类重要的挥发性香气化合物，大多具有花果香气，在朗姆酒中含量较高而阈值较低，因而对朗姆酒的香气贡献作用较大。

3 种朗姆酒中的香气成分主要是酯类、醇类、醛类、酸类4 类，另外还有少量的酮类、内酯类、酚类、烷烃类、吡喃类、含氮化合物等。哈瓦那俱乐部樽融中检测到的香气化合物数目最多且总量最高。此外，陈酿时间越长的朗姆酒中，内酯类和醛类含量占比越大且含量也越高。内酯类是由相应的羟基酸形成的，其中主要是威士忌内酯，它来源于橡木木材，主要使朗姆酒呈橡木香，是衡量陈酿朗姆酒品质的一个重要指标。醛类主要由相应的醇氧化而来，往往使朗姆酒呈现微弱的刺激性气味，其中主要是丁香醛，它主要来源于橡木桶的烘烤过程，可使朗姆酒呈现一定的刺鼻气味和辛辣味，对朗姆酒整体香气的细微差别和陈酿后朗姆酒酒体颜色的稳定有着重要的影响。

3 种朗姆酒中共检测出25 种共有香气成分，这些共有香气成分含量较高，占各自香气成分检出总量的55%以上，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-苯乙醇等香气化合物的含量较高，被认为是朗姆酒中的基本香气成分。由香气成分的OAV 分析结果可知，对3 种朗姆酒香气贡献最大的香气化合物是大马士酮，它是朗姆酒中玫瑰花香的主要来源。此外，对朗姆酒香气贡献较大的香气化合物还有辛酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、香兰素、2-苯乙醇、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、愈创木酚。通过感官评定可知，果香和花香是3 种朗姆酒的主要香气特征，其次是甜香、青香和奶香。随着朗姆酒陈酿时间的延长，其熏香、辛香和药香会明显增加，这可能与陈酿过程中橡木中木质素的降解有关。

本研究分离并分析了3 种哈瓦那俱乐部朗姆酒中的香气成分，比较了3 种朗姆酒中香气组成的异同，探究了朗姆酒随着陈酿时间延长香气组分及香气特征变化的规律，初步明确了朗姆酒中的某些关键香气化合物，这为高品质朗姆酒的品鉴及其生产工艺的优化提供了一定的理论依据。但同时可能存在未查明对朗姆酒贡献较大香气化合物的阈值的情况，这可能造成对3 种朗姆酒关键香气成分的判定及其风味轮廓的描述存在一定的偏差，有必要进一步对其他化合物的香气阈值进行测定。