陈酿方式对赤水晒醋醋醅的影响研究

2022-12-11袁治浩卢红梅李荣源徐融融

中国酿造 2022年11期

袁治浩，卢红梅 *，李荣源，陈莉，徐融融

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025；2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025）

食醋作为调味品在我国已有悠久的历史，传统的固态发酵技术使酿造的食醋富含营养成分，具有独特的药理保健功效[1]。赤水晒醋是贵州省赤水市生产的一种带有地方性特色的优质食醋产品，其主要特点是以麦麸、大米为主要原料，辅以100多种中草药配方制成的药曲，经蒸煮、发酵、日晒制成，成品醋酸味醇厚，微甜爽口，回味悠长，深受人们欢迎。

赤水晒醋采用传统的麸醋生产工艺，其醋醅曝晒阶段是一个自然的陈酿过程，整个生产周期达两年之久，且对季节气候依赖性较强[2]。在这一过程中，陈酿醋醅在品质风味上有较大提升，主要有两方面的原因，一是醋酸发酵结束后的微生物的长期作用，促进晒醋中风味物质的积累[3]；二是经曝晒产生的热作用，致使醋醅中的成分含量发生了变化，使口味更加浓厚[4]。吴震等[5]监测赤水晒醋生产过程中指标的变化，探究其品质的形成因素及发酵工艺特点；杨新等[6]研究解决了赤水晒醋中杂菌污染的问题，并提出了最佳的灭菌方案；杨沙等[7]建立了一种采用高效液相色谱法同时检测赤水晒醋中6种功能性成分的方法，以此对晒醋的质量进行分析和评价。但是，关于不同陈酿方式对赤水晒醋醋醅的影响鲜见报道，因此，该研究探究了赤水晒醋醋醅在不同陈酿方式下对其品质的影响，对比醋醅经不同陈酿方式陈酿一年后在理化指标和功能性含量上的差异及变化，为赤水晒醋的传统酿造工艺的改进及品质改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

醋醅样品：贵州省赤水某晒醋企业；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、三氯乙酸：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、甲醛、氯化钠、铁氰化钾：成都金山化学试剂有限公司；苯酚、硫酸亚铁：天津市永大化学试剂有限公司；亚硫酸钠、没食子酸、硝酸铝：天京市科密欧化学试剂有限公司；芦丁（色谱纯）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-联氮-双-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基：北京索莱宝科技有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DZ-1电位滴定仪：上海大普仪器有限公司；722S可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；FA2004N电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；SPX生化培养箱：上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 陈酿方式

将醋酸发酵结束后的醋醅装入陶坛内，设置曝晒陈酿坛、常温陈酿坛（置于阴凉处）、25 ℃控温陈酿坛、37 ℃控温陈酿坛，每组设置三个平行。

曝晒陈酿坛放置在无遮挡物的平台上，模拟生产实际中曝晒陈酿；常温陈酿坛放置在无阳光照射的阴凉处；控温陈酿坛放置在对应温度的生化培养箱内，并用温度计检测坛内温度。

1.3.2 待测样品取样

曝晒/常温醋醅上层样品：移去表面食盐，采用取样器取离表面约1/3处的醋醅200 g至取样袋中，混匀备用；

曝晒/常温醋醅下层样品：采用取样器取离陈酿坛底部约1/3处的醋醅200 g至取样袋中，混匀备用；

控温陈酿坛样品：根据曝晒/常温醋醅的取样方法，各取坛内上、下层等量的醋醅混匀，取混匀醋醅200 g至取样袋中，混匀备用。

取样编号为曝晒陈酿坛上层（MTS）、曝晒陈酿坛下层（MTX）、常温陈酿坛上层（CMTS）、常温陈酿坛下层（CMTX）、25 ℃控温陈酿（25 CP）、37 ℃控温陈酿（37 CP）。根据季节温度的差异，设定采样时间为当年1、4、6、8、10月以及次年1月，分别记为陈酿0、3、5、7、9、12个月，共6批次的样品进行检测分析。

1.3.3 样品处理方法

依照赤水晒醋传统的淋醋方法，结合课题组以往对赤水晒醋的研究，按醋醅∶水=1.0∶1.2的比例对醋醅样品进行处理，即精确称取50 g醋醅置于烧杯中，加入60 mL蒸馏水，保鲜膜封口，室温静置6 h，中速滤纸过滤，取滤液待测。

1.3.4 理化指标的测定

水分的测定：参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[8]；总酸的测定：参照GB12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[9]；还原糖的测定：DNS比色法[10]；氨基酸态氮的测定：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法[11]；可溶性无盐固形物的测定：参照GB 18186—2000《酿造酱油》[12]；总酚的测定：参照Folin-Ciocalteus法[13]；总黄酮的测定：硝酸铝比色法[14]。

1.3.5 美拉德反应初级阶段和中级阶段反应程度测定

参照谢凡等[15-17]的方法加以改进，在波长294 nm、360 nm处测定样品的吸光度值。

1.3.6 抗氧化能力的测定

DPPH自由基清除率的测定：参照安家静[18]的方法稍作改进；ABTS+自由基清除率的测定：参照吴煜樟[19]的方法稍作改进；羟基自由基清除率的测定：参照侯晓梅等[20-21]的方法稍作改进。

2 结果与分析

2.1 不同陈酿方式对陈酿过程中水分含量的影响

赤水晒醋采用传统的曝晒工艺，醋醅在曝晒过程中水分含量会随时间而减少，水分的散失让醋醅中的物质得到浓缩，使赤水晒醋的香气更加浓厚，陈酿周期赤水晒醋中水分的含量变化见图1。

图1 不同陈酿方式对水分含量的影响Fig.1 Effect of different aging method on moisture

由图1可知，醋酸发酵结束后刚转入陈酿坛时醋醅的水分含量为55.46%，在转移至发酵坛后醋醅中的水分含量随着陈酿时间的延长而逐渐降低。37 ℃控温陈酿样品在陈酿12个月后水分含量为47.11%，25 ℃控温陈酿样品中的水分含量下降趋势与曝晒陈酿上层醋醅的较为相似；曝晒陈酿上层与下层醋醅中水分差异明显，可能原因是上层醋醅受到日照的时间更长，致使醋醅中的水分在陈酿过程中挥发，但对赤水晒醋的功能性以及风味会产生一定程度的影响。

2.2 不同陈酿方式对陈酿过程中总酸的影响

食醋中的总酸是酸性物质的总量，是发酵过程中检验发酵程度的一个重要理化指标，是影响食醋酸味的主要原因，陈酿周期总酸含量的变化见图2。

图2 不同陈酿方式对总酸含量的影响Fig.2 Effect of different aging method on total acid content

由图2可知，不同陈酿方式的醋醅在为期一年的陈酿期内总酸含量持续增加，且控温陈酿醋醅样品中的总酸明显高于曝晒陈酿醋醅和常温陈酿醋醅。刚转入曝晒陈酿坛时测得总酸含量为2.08 g/100 mL，37 ℃控温陈酿样品中的总酸在陈酿12个月后达到3.31 g/100 mL，25 ℃控温陈酿次之，而常温陈酿样品的总酸含量仅为2.50 g/100 mL。赤水晒醋中总酸积累主要集中在醋酸发酵阶段，曝晒陈酿醋醅阶段中的总酸增长较小，控温陈酿样品的总酸相比于曝晒陈酿样品在此阶段有较大的增加，可能与水分的减少和陈酿温度的升高有关；有研究表明，在山西老陈醋的熏醅研究中，总酸含量在熏蒸过程中会升高，GRIMBLEBY F H[22]研究认为，加热能消除蛋白质的碱性基团，从而增加样品中的可滴定酸，使样品中的总酸含量增加。

2.3 不同陈酿方式对陈酿过程中还原糖的影响

陈酿周期还原糖含量的变化见图3。

图3 不同陈酿方式对还原糖含量的影响Fig.3 Effect of different aging method on reducing sugar content

由图3可知，在陈酿周期内醋醅中还原糖含量整体呈现先减少后增加，然后趋于平缓的趋势。刚转入陈酿坛时所测得的还原糖含量为0.64 g/100 mL，陈酿周期结束时，37 ℃控温陈酿样品中的还原糖含量为0.68 g/100 mL，25 ℃控温陈酿样品的还原糖含量为0.41 g/100 mL，常温陈酿坛上层样品的还原糖含量为0.21 g/100 mL，常温陈酿坛下层样品的还原糖含量为0.15 g/100 mL。不同陈酿方式醋醅中的还原糖含量变化有明显差异，还原糖含量在前5个月内迅速下降，而控温陈酿醋醅在陈酿周期后期还原糖含量都有所提升，且37 ℃控温陈酿样品提升的效果最明显，推测原因可能是该温度有利于酶的分解，使得残留淀粉得到进一步的利用。在秦兴[23]的研究中，赤水晒醋醋醅曝晒陈酿1年后淀粉含量从48.00 g/100 g减少到40.00 g/100 g，说明在陈酿过程中淀粉质原料会因为微生物的生长而得到进一步的分解利用，导致醋醅中的还原糖含量增加。

2.4 不同陈酿方式对陈酿过程中氨基酸态氮的影响

氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，发酵食品中的氨基酸态氮主要来源于发酵原料中的蛋白质分解和发酵过程中发生的微生物细胞自溶[24]。陈酿周期氨基酸态氮含量的变化见图4。

图4 不同陈酿方式对氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of different aging method on amino acid content

由图4可知，三种陈酿方式的醋醅在陈酿前3个月的氨基酸态氮含量都有较大幅度的增加，之后增加的趋势放缓，其中25 ℃控温陈酿样品中的氨基酸态氮含量为0.27 g/100 mL，37 ℃控温陈酿样品为0.26 g/100 mL。还原糖和氨基酸都是美拉德反应的重要底物，温度上升，还原糖和氨基酸被大量消耗，美拉德反应加剧，导致37 ℃控温陈酿醋醅中氨基酸态氮低于25 ℃陈酿；另外可能与发酵原料中的蛋白质分解和发酵过程中产蛋白酶的微生物生长活跃有关[25]。第7个月和第9个月的数据异常可能和高温时美拉德反应关联，美拉德反应会消耗醋醅中的氨基酸，这可能是造成氨基酸态氮含量在此时间段内无明显增加的原因。

2.5 不同陈酿方式对陈酿过程中可溶性无盐固形物的影响

可溶性无盐固形物是指食醋中除水、食盐外的其他可溶性物质，主要包括蛋白质的分解产物、糖类的分解产物等，是影响食醋风味和品质的重要指标。陈酿周期可溶性无盐固形物含量的变化见图5。由图5可知，醋醅中的可溶性无盐固形物随着陈酿时间的延长而增加，陈酿12个月后趋于平缓。醋酸发酵结束刚转入曝晒陈酿坛时醋醅的可溶性无盐固形物含量为6.63 g/100 mL，在陈酿周期结束时，37 ℃控温陈酿和25 ℃控温陈酿样品中的可溶性无盐固形物含量最高，分别为12.21 g/100 mL和9.95 g/100 mL，常温陈酿坛上层样品为8.48 g/100 mL，其余样品中的含量较低。陈酿温度会影响醋醅中的一些生化反应，如较高的温度会促进酯化反应的反应程度，生成的一类物质使可溶性无盐固形物含量增加，并且原料中麸皮本身含大量的α-淀粉酶、β-淀粉酶，会分解麸皮中的淀粉，导致可溶性无盐固形物增加；随着陈酿时间的延长，产酸菌大量繁殖、营养物质大量消耗使增长趋于平缓[26]。

图5 不同陈酿方式对无盐固形物含量的影响Fig.5 Effect of different aging method on salt-free solids content

2.6 不同陈酿方式对陈酿过程中总酚及总黄酮的影响

陈酿周期总酚及总黄酮含量的变化见图6。由图6可知，不同陈酿方式醋醅中总酚和总黄酮含量在陈酿过程中整体呈现上升的趋势。由图6A可知，醋酸发酵结束刚转入陈酿坛时醋醅的总酚含量为0.15 g/100 mL，醋醅总酚含量受温度影响较大，37 ℃控温陈酿样品中的总酚含量远高于其他样品，达到0.34 g/100 mL，25 ℃控温陈酿样品中的总酚含量为0.29 g/100 mL，常温陈酿样品的总酚含量最少；由图6 B可知，37 ℃控温陈酿样品中总黄酮含量从最初的0.13 g/100 mL增加至0.33 g/100 mL，25 ℃控温陈酿样品中的总黄酮含量增加至0.24 g/100 mL，分别是原来的2.6倍和1.9倍。这表明醋醅陈酿过程中在一定温度范围内温度对总酚、总黄酮含量的影响是呈正相关的，推测原因可能是温度的升高，提高了醋醅中酶的活性，使原料中的酚类、黄酮类物质得到释放，使得在醋醅中含量增加；也可能是控温陈酿导致长时间的高热环境，促进美拉德反应的进行生成还原性中间产物，并且由于长时间的较高温度，醋醅中的水分会大量蒸发，使得这些物质得到了浓缩[27-28]。

图6 不同陈酿方式对总酚（A）及总黄酮（B）含量的影响Fig.6 Effect of different aging method on total phenol (A) and total flavnoid (B) content

2.7 美拉德反应初级阶段和中级阶段反应程度的测定

美拉德反应一般可分为三个反应阶段：初级阶段、中级阶段、最终阶段。美拉德反应初级阶段主要产生酮类及醛类等小分子化合物，这类化合物在波长294 nm处有特征吸收峰，因此波长294 nm的吸光度值可反映美拉德反应所生成的初级阶段产物的量，其积累量能反映美拉德反应程度[14，29]；美拉德中级阶段主要取决于反应体系的pH：pH≤7时，其主要经1,2-烯醇化反应最终生成羰基甲基呋喃或呋喃醛；pH＞7时，进行2,3-烯醇化反应，产生还原酮类及脱氢还原酮类；继续裂解反应形成含羰基或二羰基化合物，在波长360 nm处有特征吸收峰[12]。

各陈酿方式醋醅样品中美拉德反应初级阶段及中级阶段反应程度的变化见图7。由图7A可知，随着陈酿时间的延长，醋醅中美拉德反应初级阶段的反应程度受温度的影响较小；分析原因可能是由于在反应初期，反应底物还原糖、氨基酸较充分，迅速产生大量的初级产物，随着反应底物逐渐被消耗，初级产物生成速率开始变缓；随着陈酿时间的延长，初级产物的大量生成，醋醅中的pH下降。由图7 B可知，37 ℃控温陈酿样品的中级阶段反应程度远高于其他样品，由于反应底物减少的原因，中级阶段反应程度在陈酿9个月后上升速度有所下降；温度越高，反应速率越快，达到相同吸光度值的时间越短，说明美拉德反应越剧烈。

图7 不同陈酿方式对美拉德反应初级（A）及中级（B）阶段反应程度的影响Fig.7 Effect of different aging method on the reaction degree in the primary (A) and middle (B) stage of Maillard reaction

2.8 不同陈酿方式对陈酿过程中DPPH·、ABTS+·和·OH清除能力的影响

由图8可知，在一定浓度范围内，曝晒陈酿醋醅、常温陈酿醋醅和控温陈酿醋醅均对DPPH·、ABTS+·和·OH有清除能力，且其清除能力与陈酿时间呈正相关。不同陈酿方式对3种自由基清除率都表现出37 ℃控温陈酿＞25 ℃控温陈酿＞曝晒陈酿坛上层，其中37 ℃控温陈酿、25 ℃控温陈酿、曝晒陈酿坛上层的DPPH自由基清除率分别为90.94%、89.83%、86.18%，ABTS 自由基清除率分别为86.40%、76.98%、68.52%，羟基自由基清除率分别为63.70%、56.80%、56.30%。结果表明，不同陈酿方式的醋醅均对DPPH·、ABTS+·和·OH有清除能力，且自由基清除率的变化规律随陈酿时间的延长而增强，这与样品中黄酮和总酚的变化规律一致。曝晒陈酿坛上层的3种自由基的清除能力均大于曝晒陈酿坛下层，原因可能是在曝晒陈酿过程中，表层醋醅受到阳光直晒以及热气上行的影响，造成表层醋醅的温度高于下层醋醅，而在常温陈酿醋醅中，上层醋醅与下层醋醅之间无明显差异，表明醋醅的抗氧化能力与陈酿的温度有密切联系。温度的升高，有利于美拉德反应的进行，而类黑精作为美拉德反应的一类终产物，有大量研究证实[30-34]，食品类黑精具有显著的抗氧化活性。此前研究已经发现在37 ℃控温陈酿过程中，醋醅样品中美拉德反应较为活跃，将会生成大量的美拉德反应产物，从而增加样品的抗氧化活性。

图8 不同陈酿方式对DPPH·（A）、ABTS＋·（B）及·OH（C）清除率的影响Fig.8 Effect of different aging method on DPPH·(A),ABTS＋·(B) and·OH (C) scavenging rate

3 讨论

赤水晒醋作为贵州名醋和当地的支柱产业，近年来，广泛受到大众的喜爱。但是由于赤水晒醋一致沿用传统的生产工艺，曝晒陈酿阶段耗时数年，再加上科研投入不足，导致难以科学解读曝晒对晒醋独特风格的作用以及曝晒时长对其品质的影响规律。本试验通过对3种陈酿方式醋醅的理化指标、总酚、黄酮及自由基清除率进行测定，解析曝晒工艺对赤水晒醋品质的影响。结果发现，3种醋醅陈酿方式对赤水晒醋品质的影响有明显差异，控温陈酿优于曝晒陈酿和常温陈酿，并且37 ℃控温陈酿的表现优于25 ℃控温陈酿；37 ℃控温陈酿醋醅在陈酿周期结束时的总酸含量为3.31 g/100 mL，还原糖含量为0.68 g/100 mL，氨基酸态氮含量为0.26 g/100 mL，可溶性无盐固形物含量为12.21 g/100 mL，总酚含量为0.34 g/100 mL，总黄酮含量为0.33 g/100 mL，自由基的清除率优于其他两种陈酿方式，且3种醋醅陈酿方式的黄酮、总酚及自由基清除率都随着陈酿周期的延长而增加，这与陈怡等[35]研究山西老陈醋在陈酿过程中总酚、总黄酮以及总抗氧化能力随陈酿时间增加而增加的结论一致。试验研究表明，醋醅在37 ℃控温条件下更有利于醋醅发酵成熟，对赤水晒醋的品质增强有促进作用，且短期的醋醅控温陈酿能达到更长时间曝晒陈酿的效果；从赤水晒醋的品质与产能出发，在一定程度上说明赤水晒醋的陈酿工艺有一定的改进空间，比如温度的控制范围需要进一步的探究以及更长时间的控温陈酿对醋醅品质变化影响程度仍可进一步的探索，为晒醋陈酿最佳周期的研究或生产应用提供思路。