氟吡汀和抗组胺药对小鼠福尔马林致痛的协同镇痛作用

陈衍铭,庄 涛

(江苏海洋大学 药学院,江苏 连云港 222000)

疼痛已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的第三大健康问题[1].虽然有很多有效的镇痛药,但对其安全性和不良反应的担忧日益增加,使得其临床应用存在争议,特别是阿片类药物[2].虽然对疼痛的解剖学和药理学的研究取得了显著的进展,但新的无副作用的有效镇痛药还未被开发[3].因此,疼痛的治疗仍未满足临床需求.

镇痛可以通过多种方法来实现,药物疗法是疼痛管理的主要手段之一[4].镇痛机制复杂、涉及环节多(图1),迄今还没有一种镇痛药能符合理想镇痛药的全部要求,也尚未发现有任何一种镇痛药能够对所有类型的疼痛有镇痛效果,单一的镇痛药无法满足理想镇痛治疗的全部要求,因而采用多模式镇痛是医学发展的必然结果[5].多模式镇痛已经成为临床疼痛管理的主要发展方向之一,即通过联合不同作用机制的镇痛药物和镇痛方法,阻断疼痛病理生理机制的不同时相和靶位,减少外周和中枢敏感化,取得最佳镇痛效果,同时减少镇痛药物剂量,降低药物不良反应[6].因此,临床采用镇痛药联合应用具有深远意义.

图1 多模式镇痛示意图

近几年来,钾离子通道被视为镇痛药物作用的新靶点,临床开发的药物也以钾通道开放剂为主[7].氟吡汀(Flupirtine,Flu)是一种Kv7钾通道开放剂,可通过激活内向整流钾离子通道,同时调整钾离子外流,能够稳定细胞膜电位,阻断疼痛冲动的传导[8].20世纪80年代氟吡汀在德国首次获批,同时在许多欧洲国家以及中国和巴西获得许可治疗各种疼痛,尽管其批准的适应症在各国之间有所不同,但它们对肌肉骨骼疼痛、紧张性头痛、肿瘤疼痛、痛经相关疼痛、手术和创伤性疼痛均有效[9-10].此外,有报道,氟吡汀已进入治疗神经性疼痛的II期临床试验[11].然而,氟吡汀可引起肝脏损害,因此仅限于短期使用[8].

抗组胺药物具有直接和辅助镇痛活性引起广泛关注[12].临床研究表明,异丙嗪(Promethazine,Pro)是临床上常用的吩噻嗪类抗组胺药,可作为舒马曲坦的辅助治疗剂,能有效减轻偏头痛[13].自1996年美国FDA批准非索非那定(Fexofenadine,Fex)上市以来,年处方量逐年上升,现已高达每年20多亿美元的销售量,成为美国最为畅销的抗过敏性药物之一.非索非那定是特非那定的体内代谢产物,由于该药对心脏没有毒副作用,被认为是高效、长效、低毒特点的第三代抗组胺药物(选择性组胺H1受体拮抗剂),可缓解紫杉醇引起的人类关节痛和肌痛[14].临床上,抗组胺药与阿片类药物或非甾体抗炎药联合使用.

如图2所示,越来越多的研究表明,组胺H1受体与Gq型蛋白偶联,导致下游磷脂酶C(PLC)的激活,以及磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)的水解,产生肌醇三磷酸(IP3).IP3随后扩散并与内质网上IP3受体结合,以动员存储的Ca2+.Ca2+浓度的增加激活了蛋白激酶C(PKC)依赖的磷酸化,并与钙调蛋白形成复合物(Ca2++CaM),这两种蛋白都抑制了Kv7钾离子通道,导致去极化和痛觉的增加[15-16].氟吡汀也通过激活Kv7钾离子通道,降低神经元的兴奋性,减轻疼痛症状[17].

图2 Kv7离子通道和组胺受体的潜在协同作用机理示意图

图3 福尔马林实验示意图

因此,本研究期望通过Kv7钾离子通道开放剂(氟吡汀)和抗组胺药物(异丙嗪、非索非那定)的组合,通过多种机制产生协同镇痛作用,以获得更好的镇痛效果,使副作用降到最低,更好的满足临床用药需求.

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级ICR小鼠(体重20～30 g,雌雄兼用)购自江苏省邳州市东方养殖有限公司,分组饲养,每筐8只小鼠,保持室内温度22±3 ℃,进行12小时的光/暗循环,标准的实验室食物,饮用水可自由获得.

1.2 药物

氟吡汀(批号:F878401,纯度≥99%)购自上海麦克林生化科技股份有限公司.福尔马林溶液(批号:20201102,分析纯)购自北京市通广精细化工公司.所有化合物在临用前均在无菌生理盐水中稀释,以防止化合物降解,给药体积为0.1 mL/10 g.

1.3 福尔马林实验

ICR小鼠随机分组:模型组,氟吡汀低、中、高剂量(4.3、13、39 mg/kg)组,异丙嗪低、中、高剂量(1、3、5 mg/kg)组,非索非那定低、中、高剂量(10、15、20 mg/kg)组,氟吡汀-异丙嗪联合用药组(1/8ED50+1/8ED50、1/4ED50+1/4ED50、1/2ED50+1/2ED50),氟吡汀-非索非那定联合用药组(1/8ED50+1/8ED50、1/4ED50+1/4ED50、1/2ED50+1/2ED50).实验当天,ICR小鼠右后爪套一个小金属环.测试前,让小鼠在观察室中适应至少30分钟[18].各组在灌胃给药30 min后,小鼠右后足底皮下注射1%福尔马林溶液,然后立即将小鼠放入ZH-PAN801自动疼痛分析系统中(安徽正华生物仪器设备有限公司),记录45分钟内注射福尔马林爪每分钟抬脚的次数[19].福尔马林致痛实验的特征是对疼痛的双相反应:I相(0～10 min),II相(10～45 min).镇痛效果=(模型组小鼠的抬脚次数-药物治疗组小鼠的抬脚次数)/模型组小鼠的抬脚次数×100%.

1.4 等辐射分析法

等辐射分析普遍认为是临床前研究中探索药物间药理相互作用的“金标准”[20].该方法核心准则是选择一个效应水平,并通过实验确定了单独使用药物A、单独使用药物B以及产生这种效果的组合(a,b)的剂量,产生相同效果的剂量所连接的线称为等效线,而联合后的药物作用可以a/A+b/B=γ来表示,当γ=1时,则药物之间的相互作用是相加;当γ<1时,则药物之间的相互作用是协同;当γ>1时,则药物之间的相互作用是拮抗.具体地讲,ED50 mix=a+b,a=PAED50 mix,b=PBED50 mix,ED50 mix=γA/(PA+RPB),R=A/B,ED50 add=A/(PA+RPB),ED50 mix=γED50 add,所以γ=ED50 mix/ED50 add(ED50 mix,experimental ED50;ED50 add,theoretical ED50).

1.5 数据处理

数据以mean±S.E.M.表示,并通过GraphPad Prism7.0(San Diego,CA,USA)进行分析.ED50值是通过使用线性回归分析剂量-反应曲线来计算的.梯形法则被应用于计算时间过程曲线下的面积(AUC).多重比较采用单因素或双因素方差分析(ANOVA),然后采用Dunnett检验进行多重比较.

2 结果

2.1 氟吡汀、抗组胺药对福尔马林致痛的影响

在小鼠福尔马林试验中,评估单剂量使用氟吡汀(Flu)、异丙嗪(Pro)、非索非那定(Fex)的镇痛作用.在Ⅰ相急性疼痛期,氟吡汀低、中剂量组(4.3、13 mg/kg)与模型组相比,福尔马林Ⅰ相急性疼痛期阈值无显著性差异(图4A).氟吡汀(4.3、13、39 mg/kg)以剂量依赖性的方式逆转了II相福尔马林诱发的疼痛症状(图4A),镇痛效果分别为13.0%、36.2%、75.5%,氟吡汀的半数有效量ED50=18.42 mg/kg.

异丙嗪(1、3、5 mg/kg)和非索非那定(10、15、20 mg/kg)以剂量依赖的方式逆转了II期福尔马林诱发的疼痛行为(图4B-C).此外,非索非那定能抑制福尔马林诱发的疼痛的两个阶段,而异丙嗪仅在福尔马林试验的第二阶段产生显著的抗痛觉作用.在异丙嗪组中,低中高三种剂量1、3、5mg/kg的镇痛效果分别为21.91%、36.29%、55.46%,异丙嗪的半数有效量ED50=4.49 mg/kg.在非索非那定组中,低中高三种剂量10、15、20 mg/kg的镇痛效果分别为41.41%、53.82%、65.62%,非索非那定的半数有效量ED50=12.98 mg/kg.

2.2 氟吡汀-异丙嗪、氟吡汀-非索非那定对福尔马林致痛的影响

药物组合灌胃给药后30分钟,小鼠足底皮下注射1%福尔马林,通过ZH-PAN801型疼痛自动分析系统对其进行行为学检测.氟吡汀-异丙嗪和氟吡汀-非索非那定在试验的Ⅰ相和Ⅱ相均发挥了剂量依赖性的镇痛作用(图5A-B).在氟吡汀-异丙嗪联合用药组中1/2ED50+1/2ED50(Pro 2.24 mg/kg+Flu 9.21 mg/kg),1/4ED50+1/4ED50(Pro 1.12 mg/kg+Flu 4.61 mg/kg),1/8ED50+1/8ED50(Pro 0.56 mg/kg+Flu 2.30 mg/kg)的II相镇痛效果分别为69.42%、47.13%、22.73%,明显高于各单独用药组.经数据分析,ED50 add=11.44 mg/kg,ED50 mix=6.397 mg/kg,γ=ED50 mix/ED50 add=0.56<1,表明氟吡汀和异丙嗪联用具有协同作用,详见图5C.在氟吡汀-非索非那定联合用药组中1/2ED50+1/2ED50(Fex 6.49 mg/kg+Flu 9.21 mg/kg),1/4ED50+1/4ED50(Fex3.46 mg/kg+Flu 4.61 mg/kg),1/8ED50+1/8ED50(Fex 1.62 mg/kg+Flu 2.30 mg/kg)的II相镇痛效果分别为63.46%、48.66%、36.63%,明显高于各单独用药组.经数据分析,ED50 add=15.69 mg/kg,ED50 mix=8.032 mg/kg,γ=ED50 mix/ED50 add=0.51<1,表明氟吡汀和非索非那定联用具有协同作用,详见图5D.

注：等辐射分析显示,氟吡汀与异丙嗪或非索非那定之间有协同镇痛作用(C-D).在注射1%福尔马林前30分钟给药.

3 讨论

临床上迫切需要安全有效的镇痛药,由于不同药物之间的协同镇痛作用,多模式镇痛提供了一种有效的方法,以获得更好的镇痛效果和安全性.本研究探讨了氟吡汀和异丙嗪/非索非那定联合使用在福尔马林致痛模型中是否发挥协同镇痛作用.

福尔马林疼痛模型广泛用于评估动物实验中化合物的镇痛作用,在实验小鼠的右后足底皮下注射1%福尔马林后会产生双相疼痛反应,即Ⅰ相急性疼痛和Ⅱ相炎症性疼痛[21].I相疼痛反应是初级伤害性传入感觉神经元被激活的直接结果,II相反应模拟了背角外周炎症反应和中枢敏化的联合效应[22].行为学结果显示,足底皮下注射1%福尔马林溶液后小鼠出现明显的双相痛,表现为抬脚次数显著增加.模型组在足底皮下注射0.9%生理盐水后小鼠没有出现明显的双相痛,表现为小鼠的抬脚次数在I相和II相无显著性差异.这与经典福尔马林疼痛结果相一致,表明模型建立成功.

本实验中,氟吡汀-异丙嗪组合和氟吡汀-非索非那定组合在I相和II相均有镇痛作用,而氟吡汀和异丙嗪仅在福尔马林实验的第二阶段产生显著的抗痛觉过敏作用.II阶段被认为至少部分参与了中枢敏化过程,而谷氨酸能传递在这一时期发挥了重要作用[23].氟吡汀可能通过增强Kv7/M电流来抑制II期谷氨酸溢出[24].此外,抗组胺药可以通过AMPA受体(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体)抑制谷氨酸能传递[25].与其他疼痛测试相比,福尔马林测试有两个优势:1)很少或不需要约束,允许不受阻碍地观察整个范围的行为反应;2)疼痛刺激是连续的,而不是短暂的,更接近于大多数临床疼痛.

本研究接下来可以从两个方面展开研究.1)通过膜片钳实验,研究组胺与M电流相互作用关系,进一步探究Kv7通道开放剂和抗组胺药协同作用机理;2)复方片剂具有改善服用药品依从性、提高药物疗效、减少不良反应、降低用药费用等诸多优点,在疼痛治疗中具有显著优势.接下来将继续研究氟吡汀和抗组胺药(异丙嗪、非索非那定)制备成复方片剂.

综上所述,本研究的结果为抗组胺药在福尔马林致痛模型中的镇痛作用提供了参考依据.此外,本研究发现了氟吡汀和抗组胺药的协同作用.氟吡汀与抗组胺药的协同作用为临床多模式镇痛提供了新的选择.