多壁碳纳米管对水蕨配子体发育及孢子体产生的影响

郭严冬 周义峰 郑玉红 张明霞 廖恩慧 曹建国*

（1.江苏省中国科学院植物研究所（南京中山植物园），南京 210014； 2.上海师范大学生命科学学院，上海 200234）

蕨类植物演化地位特殊，既是高等的孢子植物，又是低等的维管植物，同时具有孢子体和配子体2个世代，且均能独立存活，在植物界独有，是研究植物进化和系统发育的重要材料。中国蕨类植物资源丰富，其在食用、药用和环境指示等多个方面均有应用，且部分蕨类植物因其自身的特殊性具有重要的研究价值［1］。但由于自然生态环境的破坏、不合理开发利用，以及孢子自身寿命短、难萌发等问题，一些珍贵、稀有的野生蕨类植物资源已经濒临灭绝［2］。加强相关的繁殖技术的基础研究，对蕨类植物种质资源的利用和保护具有重要价值和现实意义。

水蕨（Ceratopteris thalictroides）是凤尾蕨科（Pteridaceae）水蕨属（Ceratopteris）植物，既是蕨类模式植物又是国家二级重点保护野生植物。水蕨在湿地生态、湖泊生态和水生景观生态中起着重要的作用，同时水蕨具有重要的观赏价值和药用价值［3］。已有研究结果表明，孢子本身的萌发力，培养基中的矿质营养［4］、糖类［5］、生长介质［6-7］和特殊化学物质［8-9］，以及培养条件［10-11］等因素都会影响孢子的萌发。例如：陆镇威［8］研究发现，纳米银显著影响水蕨孢子的萌发率和性别分化，随着纳米银浓度的增加，水蕨孢子的萌发率和雌雄同体配子体所占配子体的比例显著降低，而雄配子体没有受到显著影响。由此可见，在培养基中添加不同种类的外源物质会对水蕨萌发产生不同的影响。

多壁碳纳米管作为一维纳米材料，其径向尺寸小，具有极高的强度和极大的韧性，同时具有优异的电学和化学性能，被认为是未来的“超级纤维”。近些年随着多壁碳纳米管及纳米材料研究的深入，其广阔的应用前景也不断地展现出来。郑玉红等［12］利用碳纳米管的抗菌作用和特殊的化学性能进行了白芨（Bletilla striata）组培快繁，降低了污染率，提高了繁殖效率，并减少组培苗对植物生长调节剂的依赖，从而缩短组培苗移栽后的缓苗期，提高移栽的成活率，缩短白芨成苗的周期。目前，碳纳米管在蕨类植物中的应用较少，研究尚不深入，石雷等［13］在桫椤（Alsophila spinulosa）孢子萌发过程中添加了多壁碳纳米管，结果表明：多壁碳纳米管对桫椤孢子萌发有一定的促进作用，节约了萌发时间，但研究仅至丝状体阶段，对于后续的片状体、配子体等并未有一个完整世代的研究，且碳纳米管的添加对于性器官的形成是否有影响也并未明确。这些问题均有待深入研究。本研究以蕨类模式植物水蕨为供试材料，设置不同质量浓度的多壁碳纳米管处理，观察对水蕨配子体发育和孢子体产生的影响，以期明确碳纳米管在蕨类植物组织培养中的作用，为濒危蕨类植物的保护和繁育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为水蕨孢子，经体积分数3%NaClO3消毒1 次，12 000 r·min-1离心2 min，双蒸水清洗3次（12 000 r·min-1离心，每次2 min）后用双蒸水浸泡过夜、备用。供试基本培养基为1/2MS+6.5 g·L-1琼脂。供试多壁碳纳米管为1 mg·mL-1多壁碳纳米管母液（实验室自配），供试1/2MS 培养基（不含糖和琼脂）购自青岛捷世康生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配置

称取4.94 g 1/2MS和13.00 g琼脂粉溶于水中，加入2 mL 植物组培抗菌剂（Plant Preservative Mixture，PPM，购自美国Plant Cell Technology 公司），定容至2 L。设置多壁碳纳米管质量浓度分别为0（对照）、0.5、1.0、2.5、5.0 mg·L-15 个处理组。取1 mg·mL-1多壁碳纳米管母液分别按照设置的梯度加入上述配置好的基础培养基，调节pH 至5.8，加热溶解至无颗粒。每个处理组5个培养瓶，放于高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却后备用。

1.2.2 接种和发育情况观察

将上述孢子悬浮液接种至添加了不同质量浓度多壁碳纳米管的培养基，每个处理组接种5瓶。置于25 ℃、光照时间18 h·d-1、光照强度100～300 μmol·m-2·s-1条件下培养，每天观察孢子萌发情况，使用Mshot 生物显微镜（MS60，广州）和明美体式显微镜（MZ62，广州）拍照记录。

2 结果与分析

2.1 对水蕨配子体发育及孢子体产生的影响

在多壁碳纳米管对照组中，培养15 d 后观察到大部分孢子还未萌发（图版Ⅰ：A1），仅少量孢子的外壁开裂，或有数个细胞和假根伸出孢子壁（图版Ⅰ：A2）；培养19 d后产生片状体，片状体上有精子器（图版Ⅰ：A3）；培养32 d后片状体发育为原叶体，且原叶体上有颈卵器产生（图版Ⅰ：A4）；培养至41 d，部分原叶体上已经完成有性生殖，产生孢子体（图版Ⅰ：A5），进入孢子体世代。

在0.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理组中，培养7 d后观察到孢子已发育为片状体（图版Ⅰ：B1）；培养15 d 后片状体上产生精子器（图版Ⅰ：B2）；培养19 d 后片状体发育为原叶体，且原叶体上有颈卵器产生（图版Ⅰ：B3）；培养至32 d，颈卵器数量增多（图版Ⅰ：B4），部分原叶体上已经完成有性生殖，产生孢子体（图版Ⅰ：B5），进入孢子体世代。

在1.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理组中，培养7 d后观察到孢子已发育为片状体（图版Ⅰ：C1）；培养15 d 后片状体上产生精子器（图版Ⅰ：C2）；培养19 d 后片状体发育为原叶体，且原叶体上有颈卵器产生（图版Ⅰ：C3）；培养至32 d，颈卵器数量增多，部分原叶体在生长点附近发生营养生长，产生小的片状体（图版Ⅰ：C4）；培养至41 d原叶体上产生孢子体，进入孢子体世代（图版Ⅰ：C5）。

在2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理组中，培养7 d后观察到孢子萌发，产生由数个细胞组成的丝状体（图版Ⅰ：D1）；培养12 d 后丝状体发育为片状体，且片状体上产生数量较多的精子器（图版Ⅰ：D2）；培养15 d 后片状体发育为原叶体（图版Ⅰ：D3）；培养19 d 后原叶体上产生颈卵器，体积较大（图版Ⅰ：D4）；培养至32 d，颈卵器数量增多，部分原叶体在生长点附近发生营养生长，产生小的片状体（图版Ⅰ：D5）；培养至41 d原叶体上产生孢子体，进入孢子体世代（图版Ⅰ：D6）。

在5.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理组中，培养9 d后观察到有少量孢子出现假根伸出孢子壁（图版Ⅰ：E1）；培养16 d 后产生片状体（图版Ⅰ：E2）；培养18 d后片状体上有精子器（图版Ⅰ：E3）；培养至28 d，大部分配子体仍处于片状体阶段（图版Ⅰ：E4），偶有部分原叶体上已经完成有性生殖，产生孢子体（图版Ⅰ：E5），进入孢子体世代。

此外，总体上看，多壁碳纳米管的质量浓度越高，精子器产生的时期越早，在幼片状体时期就产生数量较多精子器的配子体为雄配子体，后期不会出现雌雄同株的现象；且高质量浓度多壁碳纳米管处理会导致部分配子体在片状体阶段就出现衰退现象，精子器退化，细胞中叶绿体出现失绿现象（图版Ⅰ：E4），部分发育出的孢子体上的细胞也出现失绿等衰退现象（图版Ⅰ：E5）。

2.2 对水蕨配子体发育及孢子体产生的影响效果

对多壁碳纳米管对水蕨的整体影响效果进行进一步总结，结果如表1 所示：与对照组相比，0.5 mg·L-1多壁碳纳米管对水蕨孢子萌发的促进效果最好，1.0～2.5 mg·L-1多壁碳纳米管的促进效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳纳米管的促进效果较弱。0.5～1.5 mg·L-1多壁碳纳米管对丝状体和片状体产生的促进效果最好，2.5 mg·L-1多壁碳纳米管的促进效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳纳米管的促进效果较弱。2.5 mg·L-1多壁碳纳米管对原叶体和孢子体产生的促进效果最好，0.5～1.5 mg·L-1多壁碳纳米管的促进效果次之，而5.0 mg·L-1多壁碳纳米管对原叶体和孢子体产生有一定的抑制作用。间［14］。本研究中，对照组水蕨孢子培养至15 d 时，大部分孢子仍未萌发。造成这种差异的原因除了培养条件有差异以外，主要原因可能是使用的培养基不同，戴锡玲等［14］使用的是改良Knop’s 培养基，该培养基在MS 培养基的基础上加入了Ca、K、

表1 不同质量浓度多壁碳纳米管对水蕨配子体发育及孢子体产生的影响Table 1 Comparison of gametophyte development and sporophyte production in water fern with different mass concentrations of multi-walled carbon nanotubes

图版Ⅰ 多壁碳纳米管对水蕨配子体发育及孢子体产生的影响A1～A5.分别是对照组水蕨孢子培养15、15、19、32、41 d 的萌发情况；B1～B5.分别是0.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理组水蕨孢子培养7、15、19、32、32 d 的萌发情况；C1～C5.分别是1.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理组水蕨孢子培养7、15、19、32、41 d 的萌发情况；D1～D6.分别是2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理组水蕨孢子培养7、12、15、19、32、41 d的萌发情况；E1～E5.分别是5.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理组水蕨孢子培养9、16、18、28、28 d的萌发情况；An.精子器；Ar.颈卵器；Sp.孢子体；PV.营养生殖产生的片状体。PlateⅠ Effects of multi-walled carbon nanotubes on gametophyte development and sporophyte production of C. thalictroide（sL.） Brongn A1-A5.The spore germination of the control group was cultured for 15，15，19，32 and 41 d，respectively；B1-B5.The spore germination of 0.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 32 d，respectively；C1-C5.The spore germination of 1.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 41 d，respectively；D1-D6.The spore germination of 2.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，12，15，19，32 and 41 d，respectively；E1-E5.The spore germination of 5.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 9，16，18，28 and 28 d，respectively；An.Antheridium；Ar.Archegonium；Sp.Sporophyte；PV.Plate produced by vegetative reproduction.

3 讨论

早期在对水蕨配子体发育的研究中发现，水蕨在4～5 d 可以萌发，6～7 d 形成丝状体，2～3 周出现性器官，但未提及片状体和原叶体出现的时Mg和Fe等营养元素，有利于蕨类孢子发育。但本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理组中的孢子萌发较快，丝状体阶段很短，培养7 d 就可以发育至片状体阶段，比对照组孢子萌发提前约15 d，且性器官出现的时间也较早，培养15 d 后就出现数量较多的精子器，培养19 d 颈卵器出现，说明多壁碳纳米管处理可以有效促进水蕨孢子萌发和配子体发育。同时也侧面说明，与培养基和培养条件相比，添加外源物质对水蕨配子体发育影响更大。这可能依赖于碳纳米管自身较大的比表面积及碳管之间较强的作用力等优良性能［15］。

本研究中，水蕨培养适宜的多壁碳纳米管质量浓度为0.5～2.5 mg·L-1。而在多壁碳纳米管对中华桫椤（Alsophila costularis）和椒样薄荷（Mentha×piperita）离体培养的研究中，发现100 mg·L-1质量浓度以下的多壁碳纳米管处理后，中华桫椤孢子萌发缩短了4 d，75 mg·L-1以上质量浓度的处理会导致假根扭曲和膨大，50 mg·L-1多壁碳纳米管是促进中华桫椤孢子在离体条件下萌发的最适质量浓度，而椒样薄荷最佳培养基中多壁碳纳米管的质量浓度为100 mg·L-1［16］。上述研究结果表明不同物种适宜的多壁碳纳米管浓度存在差异，这种种间差异也反映了植物对环境的适应性［17-18］。但不同物种均会出现“高浓度抑制”的现象，5.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理会使部分水蕨配子体在发育过程中出现衰退现象，这在植物中是普遍现象，这是因为过高浓度外源物质的添加对植物的酶活性和细胞结构等产生了复杂的影响［19-20］。李佳慧［21］的研究发现，25 mg·L-1碳纳米管对幼苗生长具有较好的促进效果，而50 mg·L-1的碳纳米管对幼苗生根的促进作用明显。本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理在水蕨片状体阶段前促进效果最为明显，2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理在片状体阶段以后促进效果较为明显。说明在实际应用过程中应根据具体的需要选择相应的添加量。

相关研究［22］表明，水蕨配子体有雌雄同株和雌雄异株之分，戴锡玲等［14］在水蕨常规培养中未观察到雄配子体。本研究观察到，在各处理组的片状体阶段就产生较多精子器的配子体一般后期会发育为雄配子体，且质量浓度较高的多壁碳纳米管处理会使片状体发生畸形，通常这类配子体上的精子器数量较多。这可能是由于多壁碳纳米管的加入使细胞的导水、导热等能力发生改变，部分孢子在有限资源环境中会为了增加生殖行为成功的几率，形成雄配子体，促进配子体之间的杂交，保证遗传的多样性［23］。

综上所述，0.5～2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理可以明显促进水蕨配子体发育和孢子体的产生，且精子器数量明显增多。0.5～2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理可使水蕨孢子萌发提前约15 d，其中，0.5～1.0 mg·L-1多壁碳纳米管处理在片状体阶段前促进效果最为明显，2.5 mg·L-1多壁碳纳米管处理在片状体阶段以后促进效果较为明显。高质量浓度（5.0 mg·L-1）多壁碳纳米管处理会使水蕨配子体发育出现“高浓度抑制”现象。建议根据实际研究目的或生产需要选择多壁碳纳米管质量浓度。