马蔺花器官表型特征及色素分析

李 楠 田小霞 毛培春 郑明利 孟 林 云 岚

（1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，呼和浩特 010000； 2.北京市农林科学院草业花卉与景观生态研究所，北京 100097）

马蔺（Iris lacteavar.chinensis）为鸢尾科（Iridaceae）鸢尾属（Iris）多年生宿根草本植物，广泛分布于我国西北、华北、东北等地区［1-2］，因其适应性强，花色艳丽，花期较长，株型美观等优良特性，已成为重要的城市园林绿化观赏植物。目前国内外对马蔺的研究主要集中在生态修复、土壤改良和药用价值等方面［3-5］，但关于马蔺花色的研究较少，仅对马蔺花青素合成途径的DFR基因生物信息学特征进行分析［6］，关于马蔺花色分类和色素组成却未见深入的研究。花色是观赏植物最重要的观赏性状之一，也是品种分类的重要依据［7］，因此研究马蔺花瓣呈色机理，对其优良种质资源挖掘、品种鉴定及新奇花色品种培育具有重要意义。

目前植物花色的研究主要集中在色素成分含量测定、花瓣呈色机理和花色分子育种等方面，如菊 花（Chrysanthemum morifolium）［8］、月 季（Rosachinchinensis）［9］、丽格海 棠（Rieger begonias）［10］和黄牡丹（Paeonia delavayivar.lutea）［11］等植物都有相关研究报道。植物花色的形成受到色素种类和含量、花瓣表皮细胞结构、液泡pH、金属离子螯合作用等内部因素［12-13］及光照温度等外部环境因素［14］的影响，其中最重要的是色素种类和含量，如类黄酮、类胡萝卜素和花色苷等［15-16］。

以往研究将马蔺花色区分为淡蓝色、蓝紫色或深蓝紫色［17-18］，但有关马蔺花色素组分及质量分数的研究鲜见报道。故本研究通过系统聚类和相关性分析等方法，对中国6个省市不同生境条件下22 份马蔺种质材料的花色、垂瓣花斑和花葶等表型性状进行测定描述，结合色素比较分析，揭示马蔺花色与色素质量分数间相关关系，明确影响花色形成的主要物质，以期为阐明马蔺花色呈色机理奠定基础，为马蔺新种质创制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

将收集到的中国6 个省市不同生境条件下22 份马蔺种质资源种子（见表1），于2018 年室内育苗后单株定植移栽到位于北京市昌平区小汤山镇的国家精准农业研究示范园草种质资源圃（40°9′16″N，116°24′32″E），生长环境养护管理一致。

表1 马蔺种质材料种源及原生境信息Table 1 Provenance and original habitat information of I. lactea germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 花部性状的观测

试验于2022年4月20日—5月20日在国家精准农业研究示范园草种质资源圃进行，选择晴天上午对供试的22份马蔺种质材料（见表1）5年生的健康生长植株于初花期测定花葶高度，盛花期测定花的其他表型性状（见表2）。重复3次，取平均值。

表2 马蔺花部表型性状及描述Table 2 Phenotypic traits and description of I. lactea flower

在室内自然光照下（无阳光直射），分别将旗瓣和垂瓣置于白色A4 纸上，用英国皇家园艺比色卡（RHS Color Chart）与其正面对比，用比色卡上最接近花色的代码表示其颜色，确定所属色系范围和编号，初步确定旗瓣和垂瓣的花色；然后再用分光色差仪（NF555，日本）在C/2°光源下按CIE Lab表色系统测定垂瓣和旗瓣显色位置（见图1）的明度（L*）、红度（a*）和蓝度（b*），计算彩度（c*）和色相角（h）。重复3 次，取平均值。计算公式：c*=（a*2+b*2）1/2；h=arctan（b*/a*）。

图1 花瓣测色部位A.垂瓣；B.旗瓣。Fig.1 Measuring parts for petal color A.Fall；B.Standard.

1.2.2 色素质量分数的测定

每份马蔺种质材料选择10 个单株，每个单株采集10 朵花，随后立即放入冰盒。每份去除雄蕊后，选择前2/3 部位混合称取0.1 g，置于2 mL离心管，经液氮速冻后，放入冰箱-80 ℃保存备用。

花瓣类胡萝卜素质量分数测定参考高俊凤［19］的方法。取花瓣0.1 g，置于10 mL 95%乙醇（NR-分析纯）的溶液中，避光浸提48 h 直到花瓣变白，取浸提液，用分光光度计分别测定波长为665、649、470 nm 的吸光值（A665，A649，A470），按如下公式计算：

式中：Ca、Cb、C分别为叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素的质量浓度（mg·L-1），V为提取液体积（mL），m为样品鲜质量（g）。

类黄酮质量分数采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法［20］测定，取花瓣0.1 g，加入2 mL 60%乙醇溶液充分研磨，60 ℃振荡提取2 h，于10 000g常温离心10 min，取上清液；分别吸取540 μL 上清液和蒸馏水置于2 个2 mL 离心管，各加30 μL 5% NaNO2溶液混匀；静置6 min 后分别加30 μL 10% AlNO3溶液，5 min 后再加400 μL 5% NaOH 溶液，室温静置15 min 后用分光光度计测定510 nm 处的吸光值，按如下公式计算：

式中：ΔA类黄酮、A测定、A空白分别为类黄酮、测定组和空白组的吸光值，V样总为加入提取液体积（mL），m为样品鲜质量（g）。

花色苷质量分数采用pH 示差法［21］测定。取花瓣0.1 g，加入1 mL 含1% HCl 的甲醇溶液充分研磨，使用金属震荡仪震荡4 h 后，于8 000g常温离心10 min，取上清液；每个样品各取100 μL上清液于2 mL 离心管中，分别加入pH=1.0 的KCl-HCl缓冲液和pH=4.5的醋酸钠-醋酸缓冲液900 μL，充分摇匀，40 ℃水浴20 min，用分光光度计分别测定波长为530 nm 和700 nm 处的吸光值（A530，A700），按如下公式计算：

式中：ΔA花色苷为花色苷吸光值，V为提取液体积（mL），M为花色苷的相对分子质量（g·mol-1），F为稀释倍数，ε为花色苷的摩尔消光系数（L·mol-1·cm-1），d为比色皿光径（cm），m为样品鲜质量（g）。

各指标测定时每份材料3次生物学重复，取平均值。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel、IBM SPSS Statistics、Origin 2021 软件进行数据处理和作图。采用组间联接法对测得的垂旗瓣测色参数L*、a*和b*值进行系统聚类分析，采用皮尔逊系数对垂旗瓣颜色参数和色素质量分数进行相关性分析，采用Duncan’s新复极差法对各指标数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 马蔺花色表型特征

利用CIE Lab 测色体系，测得22 份马蔺种质材料的旗瓣和垂瓣测色参数L*、a*和b*值并对其标准化处理，组间联接法的系统聚类分析结果表明，当欧式距离为5.5 时，可将22 份马蔺种质材料花色划分为4 大色系（见图2），即浅蓝色、浅蓝紫色、深蓝紫色和紫罗兰色。其中深蓝紫色的种质材料有8份，占比达36.26%，浅蓝紫色有7份，占比31.82%，紫罗兰色有5 份，占比22.73%；数量最少的是浅蓝色系，仅有2份。

图2 基于L*、a*和b*值的22份马蔺种质花瓣花色表型聚类分析Fig.2 Cluster analysis of petal color phenotypes of 22 I. lactea germplasm resources based on L*，a* and b* values

通过CIEL*、a*和b*颜色体系得到22 份马蔺种质资源（4 大色系）花色参数分布范围（见图3）。马蔺种质垂瓣和旗瓣颜色的L*值和b*值随花色加深而逐渐下降，而a*值随花色加深呈上升趋势。各色系的垂瓣和旗瓣L*值均在20～70，a*值在0～50，b*值在-5～-55波动。

图3 马蔺种质4大色系的花色L*、a*和b*值箱式图A.旗瓣L*值；B.垂瓣L*值；C.旗瓣a*值；D.垂瓣a*值；E.旗瓣b*值；F.垂瓣b*值。Fig.3 The box plot of L*，a* and b* values of four color lines I. lactea germplasm resources A.Standard L* value；B.Fall L* value；C.Standard a* value；D.Fall a* value；E.Standard b* value；F.Fall b* value.

马蔺种质资源4 大色系中，浅蓝色系花色L*最高，其次为浅蓝紫色系和深蓝紫色系，明度最低的是紫罗兰色系，说明马蔺花色越浅，L*值越高，4 大色系间无重叠。a*值从高到低依次为紫罗兰色系、深蓝紫色系、浅蓝紫色系和浅蓝色系，说明马蔺花色越深红度越大，其中浅蓝色系和浅蓝紫色系分布集中，深蓝紫色系和紫罗兰色系分布范围大；而b*值最高的是浅蓝色系，从高到低依次为浅蓝色系、浅蓝紫色系、深蓝紫色系和紫罗兰色系，说明蓝度随马蔺花色加深而增加，其中紫罗兰色系分布最集中，4大色系均分布在负值范围内。

由图4可知，马蔺旗瓣和垂瓣花色均集中分布在第Ⅳ象限，在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限没有分布，4 大色系的分布规律大致呈条带状。其中，旗瓣浅蓝紫色系和深蓝紫色系存在部分重叠。a*和L*呈负相关，即随红度的增加，浅蓝色、浅蓝紫色、深蓝紫色和紫罗兰色的明度逐渐减小。4 大色系的b*和L*间呈正相关，即随b*值增加，L*值逐渐增加。4 大色系的c*值与L*值间呈负相关。旗瓣和垂瓣的L*值均随c*值增大而减小。其中，旗瓣L*值随c*值增大而变小，且斜率较大，拟合线性方程为：L*=-0.80c*+78.60（R2=0.83）；垂瓣的趋势类似于旗瓣，但c*和L*斜率更小，拟合线性方程：L*=-0.59c*+69.78（R2=0.76）。

图4 马蔺种质资源花色表型分布A.旗瓣a*与旗瓣b*分布；B.垂瓣a*与垂瓣b*分布；C.旗瓣a*与旗瓣L*分布；D.垂瓣a*与垂瓣L*分布；E.旗瓣b*与旗瓣L*分布；F.垂瓣b*与垂瓣L*分布；G.旗瓣c*与旗瓣L*分布；H.垂瓣c*与垂瓣L*分布。Fig.4 Flower color phenotype distribution of I. lactea germplasm resources A.The distribution of standard a* and standard b*；B.The distribution of fall a* and fall b*；C.The distribution of standard a* and standard L*；D.The distribution of fall a* and fall L*；E.The distribution of standard b* and standard L*；F.The distribution of fall b* and fall L*；G.The distribution of standard c* and standard L*；H.The distribution of fall c* and fall L*.

2.2 马蔺花器官表型性状分析

马蔺种质资源花器官表型性状的分析结果表明，4大色系的马蔺种质资源花器官表型性状存在显著差异（P<0.05）（见表3）。马蔺种质资源花色越深，花瓣越大。紫罗兰色系和深蓝紫色的垂瓣长度和宽度均显著高于蓝紫色系和浅蓝色系，紫罗兰色系的垂瓣长度和宽度的平均值分别为5.98、1.27 cm，较浅蓝色系显著增加了30.00%和44.32%（P<0.05）；紫罗兰色系和深蓝紫色的旗瓣长度显著高于蓝紫色系和浅蓝色系；浅蓝紫色系的旗瓣宽度显著低于其他色系，其中紫罗兰色系的旗瓣长度和宽度最大，分别为5.68 和0.97 cm，较浅蓝色系的增加了17.11%和21.25%；紫罗兰色系平均花径（5.09 cm）与浅蓝色系的花茎呈显著差异（P<0.05），为浅蓝色系的1.17倍。

表3 马蔺种质各色系花器官表型性状Table 3 Phenotypic traits of floral organ of different color lines of I. lactea germplasm resources

随花色的加深，花葶高度呈上升趋势，紫罗兰色系花葶高度达29.10 cm，较浅蓝色系的增加了8 cm，且与浅蓝色系的花葶高度呈显著差异（P<0.05）。垂瓣花斑随颜色的增加而减小，其中，紫罗兰色系的平均垂瓣花斑大小（0.26）显著低于其他色系，为浅蓝色系花瓣的81.25%。

2.3 马蔺花瓣色素质量分数分析

马蔺种质资源盛花期花瓣的类胡萝卜素、类黄酮及花色苷质量分数的分析结果如图5 所示，类胡萝卜素质量分数整体处于较低水平，小于0.006 5 mg·g-1，且从高到低依次为浅蓝色、浅蓝紫色、深蓝紫色、紫罗兰色，其中浅蓝色系类胡萝卜素质量分数较高，达0.004 9 mg·g-1，其他3 大色系的类胡萝卜素质量分数均低于0.001 5 mg·g-1。特别是紫罗兰色系中没有检测到类胡萝卜素（见图5A）。类黄酮质量分数为0.513 3～1.343 8 mg·g-1，其中紫罗兰色系类黄酮质量分数最高且与浅蓝紫色系和浅蓝色系类黄酮质量分数呈显著差异（P<0.05），与深蓝紫色系类黄酮质量分数差异不显著（P>0.05）。浅蓝色系类黄酮质量分数仅为0.660 5 mg·g-1，较紫罗兰色系类黄酮质量分数降低了44.59%（见图5B）。花色苷作为一类重要的类黄酮物质，对花色呈现非常重要。马蔺花瓣花色苷质量分数变化趋势与类黄酮质量分数变化趋势相似（见图5C），花色苷质量分数从大到小依次为紫罗兰色、深蓝紫色、浅蓝紫色、浅蓝色，其中紫罗兰色系花色苷质量分数（0.433 3 mg·g-1）显著高于其他色系（P<0.05），其次是深蓝紫色系和浅蓝紫色系，质量分数为0.223 5～0.326 7 mg·g-1，而浅蓝色系花色苷质量分数仅为0.173 7 mg·g-1。

图5 各色系马蔺花瓣色素质量分数A.类胡萝卜素质量分数；B.类黄酮质量分数；C.花色苷质量分数。Fig.5 Pigment mass fraction of petals of different color lines of I. lactea A.Mass fraction of carotenoid；B.Mass fraction of flavonoid；C.Mass fraction of anthocyanin.

2.4 马蔺垂旗瓣颜色参数与色素质量分数的相关性

由表4可知，马蔺种质资源垂旗瓣颜色参数与花瓣中的色素质量分数关系密切，随着类胡萝卜素质量分数降低，类黄酮质量分数特别是其中的花色苷质量分数逐渐升高，垂旗瓣的明度L*降低、红度a*升高、蓝度b*降低、彩度c*升高和色相角h升高。垂旗瓣L*与类胡萝卜素质量分数呈显著正相关（P<0.05）、与类黄酮和花色苷质量分数均呈极显著负相关（P<0.01）；垂旗瓣a*与类胡萝卜素质量分数呈显著负相关、与类黄酮和花色苷质量分数均呈极显著正相关（P<0.01）；垂旗瓣b*与类胡萝卜素质量分数呈正相关、与类黄酮和花色苷质量分数呈负相关；垂旗瓣c*与类胡萝卜素质量分数呈显著负相关（P<0.05）、与类黄酮质量分数呈显著正相关（P<0.05）、与花色苷质量分数呈极显著正相关（P<0.01）；垂旗瓣h与类胡萝卜素呈负相关、与类黄酮和花色苷质量分数呈正相关。

表4 马蔺种质资源CIE Lab参数与色素质量分数的皮尔逊相关性Table 4 Pearson correlation analysis between CIE Lab parameters and the mass fraction of pigment in I. lactea germplasm resources

3 讨论

花色是园林植物最重要的观赏性状，关于花色测定方法主要有目测法、比色卡比色法和色差仪测色法［22-23］。目测法因颜色分类标准的不同和测色人员的视觉差异，很难对花色特别是交叉色系进行准确判定［24］。比色卡比色法是园林植物测色研究应用最广泛的方法，但测色环境的背景颜色和光照要求相对比较严格［25-26］。色差仪测色法具有精度高、环境因素影响小、颜色数据化等优点，被广泛应用于观赏植物花色测定［27-29］。因此，本研究采用了比色卡比色法结合色差仪测色法对22份马蔺种质材料的花旗瓣和垂瓣色彩参数进行测量分析，并依据色彩参数的聚类结果将供试的22 份马蔺种质材料花瓣分为4 大色系，即浅蓝色、浅蓝紫色、深蓝紫色和紫罗兰色。这与王育青［18］对马蔺花器官表型的研究结果基本一致。

花色差异与花瓣色素成分和比例密切相关。植物花色素主要有类胡萝卜素、类黄酮和甜菜色素［30-31］。类胡萝卜素是一类脂溶性的天然色素，绝大多数呈黄色、橙色和红色［32］。类黄酮即黄酮类化合物，包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、查尔酮、花色苷和黄烷酮类6大类，使植物呈蓝色、红色、紫色等颜色［33］。其中，类黄酮中的花色苷对植物花色表达发挥着重要作用［34］。Conner 等［34］研究发现青铜色和粉色浆果中花色苷含量低于100 mg·g-1，而高度色素化的黑浆果中花色苷含量超过5500 mg·g-1，且花色苷含量随花色加深而增加。本研究结果表明，22 份马蔺种质花瓣中只有少量种质含有类胡萝卜素，且随花色加深呈下降趋势，可见类胡萝卜素对马蔺花瓣呈色的影响较小；类黄酮和花色苷质量分数均随花色加深而逐渐增加，表明类黄酮和花色苷是决定马蔺花瓣颜色的主要呈色物质，且垂瓣和旗瓣中花色苷质量分数不同是引起马蔺花色表型特征变化的重要因素。

花色苷含量不同会影响植物花色明度（L*）、红度（a*）、蓝度（b*）和彩度（c*）的变化［35］。本研究22 份马蔺种质垂旗瓣的L*值由低到高依次为紫罗兰色、深蓝紫色、浅蓝紫色和浅蓝色，且L*值与花色苷质量分数呈极显著负相关，即随着花色苷的积累明度下降，这与Lu 等［36］对盆栽多花菊（Chrysanthemum×morifolium）、Li 等［37］对草莓属（Fragaria）植物花色苷含量对花色明度影响的研究结果一致，说明花色苷质量分数的变化是影响马蔺花色明暗变化的重要因素之一。花色苷质量分数与马蔺垂旗瓣的红度、蓝度及彩度值相关性分析结果表明，随着花色苷质量分数增加，垂旗瓣红度和蓝度值增加，这与Junka等［38］报道万代兰属（Vanda）植物花瓣a*和b*值与花色苷含量呈极显著正相关的结论相符。随着花色苷质量分数增加，马蔺垂旗瓣的彩度值增加，这与Zhu 等［39］报道睡莲属（Nymphaea）植物c*值与花色苷含量呈显著正相关的结论一致，即花色苷质量分数与彩度值呈显著正相关。

综上所述，通过对中国6个省区不同生境条件22份马蔺种质花器官表型特征及色素质量分数的分析结果表明，不同色系马蔺花器官表型特征和色素质量分数存在差异，即花瓣颜色越深，花瓣越大，垂瓣花斑越小；随着马蔺花色越紫，类胡萝卜素质量分数越低，类黄酮和花色苷质量分数则逐渐上升，并与测色参数L*、a*和b*值间存在一定相关性，结果可为马蔺种质资源花色形成机制的研究及新种质的创制奠定重要基础。