Neuritin结构组成分析及其相互作用蛋白生物信息学预测

李煜　孟平平　王宿洁　朱礼彦　朱金辉　陈仁伟　杨磊

摘要：目的 对Neuritin的理化性质及结构組成，蛋白质相互作用网络进行生物信息学预测分析，为进一步研究Neuritin的功能和作用机制提供新的思路与方向。方法 应用Protscale 和ProtParam、TMHMM、SignalP、PSORTⅡ、NetNGlyc、NetOGlyc 和 Netphos等软件，分析Neuritin的理化性质、跨膜结构、信号肽结构、亚细胞定位以及翻译后修饰位点；利用Protean、tFold以及AlaphFold等软件和数据库，分析Neuritin的二级和三级结构；同时，利用STRING数据库构建Neuritin蛋白质相互作用网络。结果 Neuritin的相对分子质量为15 332.77，理论等电点（PI）为6.54。不稳定系数27.26，属于较稳定蛋白；脂肪系数98.31；总平均亲水性0.208，属于疏水性蛋白；Neuritin表达产物N端27个氨基酸为信号肽，C端27个氨基酸为GPI锚定序列，为跨膜区；其亚细胞定位及可能性分别为胞外（34.8%）、细胞膜（34.8%）、内质网（17.4%）及高尔基体（13.0%）；无N糖基化及O糖基化位点，存在11个磷酸化位点；由5段α-螺旋构成其主体结构；相互作用蛋白网络包括离子型谷氨酸受体AMPA（Gria）家族、嗅觉介导素（Olfm）家族等10个蛋白。结论 Neuritin为经典的分泌蛋白，具有多个磷酸化氨基酸残基的潜在位点，整体呈现疏水性质，可能通过Gria蛋白家族发挥兴奋性突触传递作用，通过Cacng2蛋白调控胞内钙通路产生生物学效应，本研究为进一步探讨Neuritin的功能及发挥作用的机制提供了依据。

关键词：Neuritin；理化性质；结构预测；蛋白质相互作用网络；生物信息学

中图分类号：R34中图分类号文献标志码：A文献标识码

Structural composition analysis of Neuritin and bioinformatics prediction of

its interactive proteins

LI  Yu1，MENG  Pingping1，WANG  Sujie1，ZHU  Liyan1，ZHU  Jinhui1，CHEN  Renwei2，YANG  Lei2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China; 2 Department of Medicine， Hangzhou Normal

University， Hangzhou，Zhejiang 310036，China）

Abstract：  Objective To predict and analyze the physical and chemical properties， structural composition and protein-protein interaction network of Neuritin by bioinformatics， so as to provide new ideas and directions for the further study of the function and mechanism of Neuritin. Methods The physicochemical properties， transmembrane structure， signal peptide structure， subcellular localization and post-translational modification sites of Neuritin were analyzed by using Protscale and Protparam， TMHMM， Signalp， PSORTⅡ， NetNGlyc， NetOGlyc and Netphos software. Analyze the secondary and tertiary structure of Neuritin by using Protean， tFold， AlaphFold and other software and databases; Meanwhile， the Neuritin protein interaction network was constructed by using string database.Results The relative molecular weight of Neuritin was 15 332.77， the theoretical isoelectric point （PI） was 6.54and the theoretical isoelectric point （PI） was 6.54. The instability coefficient is 27.26， which belongs to a relatively stable protein. The fat coefficient is 98.31. The total average hydrophilicity is 0.208， which belongs to hydrophobic protein. The N-terminal 27 amino acids of Neuritin expression product are signal peptides， and the C-terminal 27 amino acids are GPI anchored sequences， which are transmembrane regions. The subcellular localization and possibility were extracellular （34.8%）， cell membrane （34.8%）， endoplasmic reticulum （17.4%） and Golgi apparatus （13.0%）. There were 11 potential phosphorylation sites of amino acid residues without N-glycosylation and O-glycosylation sites. By five α-paragraphs the spiral forms its main structure. The interacting protein network includes 10 proteins such as glutamate AMPA ion channel receptor （Gria） family and olfactory mediators （Olfm） family. Conclusion Neuritin is a classic secretory protein with multiple phosphorylation sites and hydrophobic properties. It may play the role of excitatory synaptic transmission through Gria protein family and regulate the intracellular calcium pathway through Cacng2 protein to produce biological effects. This study provides a basis for further exploring the function and mechanism of Neuritin.

Key words： Neuritin;physical and chemical properties;structural prediction;protein protein interaction network;bioinformatics

隨着脊髓损伤（Spinal cord injury， SCI）、阿尔兹海默病（Alzheimers disease， AD），脑血管意外（Cerebrovascular accident， CVA）等疾病呈现高发生率、高致残率等特点，神经退行性疾病已成为威胁人类生存质量的主要疾患［1-3］。提高受损神经的修复能力，改善患者的生存质量，成为亟待解决的严重社会问题和科学问题。治疗神经系统疾患的关键是有效地维持神经元的存活、促进突起生长并建立新的突触联系，各种神经营养因子在上述过程中发挥着非常重要的作用。Neuritin是在神经发育和可塑性中发挥重要作用的神经营养因子，能够明显促进神经突起的生长及其分支形成和突触的发育成熟［4］，调节突触回路的形成［5］；并可抑制凋亡，维持神经元的存活，可能是胚胎发育中唯一维持神经元存活的神经营养因子［6］。研究显示Neuritin与损伤后的神经再生和修复、学习记忆密切相关，是神经生长因子（Nerve growth factor， NGF）、脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor， BDNF）、雄激素发挥作用的重要效应因子［7］，且能改善AD模型鼠的认知功能。由此可见，Neuritin与神经网络和突触环路的形成密切相关，是影响生物体学习记忆的重要因子。但当前对Neuritin的研究主要集中在其表达水平与生物学功能方面，对其结构与功能的关系尚待进一步研究，对其发挥生物学功能的具体机制及下游相互作用蛋白尚不清楚。为进一步研究Neuritin的性质，探讨其发挥生物学功能的方式及下游相关相互作用蛋白，对其进行结构组成分析及生物信息学预测研究。

本研究通过应用多种生物信息学软件对Neuritin的理化性质、结构、功能及相互作用等进行分析，通过组成分析明确Neuritin蛋白的基本性质，通过结构预测判断Neuritin主要的功能基团，观察其结构骨架，通过相互作用蛋白分析预测Neuritin的作用靶点，推测其可能发挥作用的机制，为进一步研究Neuritin的功能与作用机制提供新的思路与方向。

1 材料与方法

1.1 Neuritin理化性质及序列分析

在National Center for Biotechnology Information（NCBI）网站获取Neuritin的氨基酸序列，其GeneBank登录号为AAF62371.1。应用在线软件ExPASY ProtParam（https：//web.expasy.org/ protparam /）分析Neuritin理化性质和一级结构，应用ExPASY ProtScale分析Neuritin亲疏水性（https：//web.expasy.org/protscale/）［8］。此外，利用SignalP 5.0 Server对Neuritin进行信号肽序列分析，判断标准为SP值是否高于0.5；同时利用CS值寻找剪切位点［9］。通过TMHMM Server v. 2. 0进行 PLAC8 跨膜区域分析（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）［10］。利用 PSORTⅡ进行PLAC8 亚细胞定位分析（https：//psort.hgc.jp/form2.html）。

1.2 Neuritin二级及三级结构预测

应用Protean软件Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法预测Neuritin蛋白二级结构。使用tFold利用从头合成原理预测Neuritin蛋白三级结构［11］；同时，利用Alaphfold开源数据库获取Neuritin蛋白全长预测结构［12-13］。

1.3 Neuritin翻译后修饰位点分析

利用在线软件NetNGlyc 1.0 Server［14］及NetOGlyc 4.0 Server［15］进行N-糖基化位点和O-糖基化位点分析，利用Netphos 2. 0 Server［16］对Neuritin的磷酸化位点进行分析。

1.4 Neuritin相互作用蛋白预测

通过STRING数据库寻找与 PLAC8 相互作用的蛋白并构建蛋白质相互作用网络，设置为高置信度，置信度score值为0.9，蛋白数量少于10［17］。

2 结果

2.1 Neuritin活性片段的理化性质

ExPASY ProtParam分析结果显示，Neuritin全长142个氨基酸，相对分子质量为15332.77，理论等电点（PI）为6.54。组成Neuritin的氨基酸共20种，其中亮氨酸（Leu）含量最高，为14.8%，含量最少为组氨酸，仅0.7%（图1）。当Neuritin 6个半胱氨酸全部游离情况下、消光系数为1.465；在6个半胱氨酸全部形成二硫键情况下、消光系数为1.489；不稳定系数27.26，属于较稳定蛋白，脂肪系数98.31；总平均亲水性0.208，整体亲水。此外，ExPASY ProtScale分析Neuritin亲疏水性结果显示，可见Neuritin总体疏水区大于亲水区，其中疏水性最大的为第14位亮氨酸，分值为2.533；亲水性最大的为第96位赖氨酸，分值为-2.633（图2）。

2.2 Neuritin的序列分析

对Neuritin进行序列分析，首先是信号肽及剪切位点预测方面，SignalP 5.0 Server预测结果显示，Neuritin为经典的分泌型蛋白，信号肽序列为1-27位氨基酸，SP均值大于0.5；27位丙氨酸（Ala）C值最大，为信号肽剪切位点（图3）。其次为跨膜结构方面，TMHMM Server2.0预测结果提示，除前述N端27个氨基酸所构成的信号肽外，尚有116-142号位氨基酸所组成的跨膜序列，考虑为GPI锚定序列（图4）。此外，亚细胞定位方面，PSORT II预测结果显示，Neuritin定位于不同位置的可能性分别为胞外（34.8%）、细胞膜（34.8%）、内质网（17.4%）及高尔基体（13.0%）。

2.3 Neuritin二级及三级结构预测

应用Protean软件Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法预测Neuritin蛋白二级结构，其中使用Garnier-Robson、Chou-Fasman分析Neuritin α-螺旋、β-折叠区域；应用Garnier-Robson、Chou-Fasman及Karplus-Schulz方法预测柔性区域（图5）。使用tFold利用从头折叠的原理预测Neuritin蛋白三级结构，同时又利用Alaphfold开源数据库获取了Neuritin蛋白预测结构，两数据库预测结果除C端GPI锚定序列处略有差别外，其余部分趋势相同。Neuritin由五段α-螺旋构成其主体结构，其中N端27个氨基酸为信号肽，C端27个氨基酸为GPI锚定序列（图6）。

2.4 Neuritin翻译后修饰分析预测

应用在线软件NetNGlyc 1.0 Server及NetOGlyc 4.0 Server进行N-糖基化位点和O-糖基化位点分析，结果显示Neuritin无N-糖基化位点及O-糖基化位点；应用在线软件Netphos 3.1 Server进行磷酸化氨基酸残基的位点预测，结果显示Neuritin具有11个磷酸化氨基酸残基的潜在位点（图7），具体氨基酸位点信息如下（表1）。

2.5 Neuritin相互作用蛋白预测

STRING数据库预测结果显示，按置信度（score）排序，从高到低选取十个相互作用蛋白构成Neuritin（142个氨基酸）蛋白质相互作用网络（图8），主要包括了Gria蛋白家族，OLFM蛋白家族以及Cacng2等，具体蛋白信息及置信度如下（表2）。

3 讨论

Neuritin具有促进神经元突起生长，抑制凋亡，促进突触发育成熟，维持神经元存活等生物学功能，在神经发育、损伤后修复和学习记忆中发挥重要作用［4-6］。本研究利用各种生物信息学软件对Neuritin进行结构组成及相互作用蛋白网络的预测分析，通过上述预测分析，明确了Neuritin的基本结构组成，包括亚细胞分布、结构骨架、信号肽、锚定位点，翻译后修饰等，同时，建立了Neuritin相互作用蛋白网络，发现其相互作用蛋白的功能主要集中在神经发育、突触可塑性及抑制细胞凋亡等方面。

本研究利用的生物信息学方法均为公认可靠的方法，针对Neuritin进行一级结构分析可以明确，Neuritin位于人基因组6p25.3，全长2072bp，表达产物由142个氨基酸残基构成，其中1-27位氨基酸残基为信号肽，28-115位氨基酸为活性片段，116-142位氨基酸为跨膜锚定序列。从系统进化角度而言，Neuritin氨基酸序列高度保守，多种物种序列分析显示，其氨基酸组成无明显差异。同时，Neuritin是经典的分泌型蛋白，分泌后以锚定型形式利用GPI锚定位点锚定在细胞膜上发挥功能。

Garnier-Robson、Chou-Fasman方法广泛应用于蛋白质二级结构预测中。Chou-Fasman方法主要根据残基的倾向性因子，沿蛋白序列寻找二级结构的成核位点和终止位点从而进行预测，而Garnier-Robson方法不仅考虑到被预测位置本身氨基酸残基种类对该位置构象的影响，也对相邻氨基酸残基序列进行综合分析，这种方法提高了预测的置信度。针对Neuritin蛋白而言，在24-46位、98-123位氨基酸残基处，两种方法预测结果存在部分差异，考虑是1-27位信号肽序列以及115-142位GPI锚定序列影响了上述方法对于二级结构的预测。综合以上两种方法预测结果，可认为Neuritin结构骨架主要由α-螺旋及β-折叠构成，5-45位、75-82以及105-142位氨基酸残基所形成的3个较大α-螺旋区域，维持了Neuritin蛋白的稳定结构，符合其高疏水性的特点，而45-60位氨基酸残基及80-105位氨基酸残基处为表面可及区域，与这部分氨基酸残基呈现高亲水性特点有关，可能参与其功能基团的形成。

蛋白三级结构预测是生物信息学研究中的一个重要的研究方向，提高蛋白结构预测的准确度，对药物作用靶点的发现，蛋白质相互作用的具体机制以及蛋白结构的解析具有重要意义。腾讯AI Lab科研团队利用“从头折叠”的原理研发AI工具“tFold”，用以预测蛋白的三级结构，并将其用于“分子置换”的初始构型来解析晶体数据，有效提升了蛋白结构预测精度［11］。Alaphfold是一个基于神经网络的计算模型，该方法结合蛋白的物理和生物学方法，利用多序列比对来设计深度学习算法，其准确度可达到原子水平［12-13］。tFold以及从AlaphFold开源数据库所获取的Neuritin三级结构预测分析结果主要趨势一致，与前述亲疏水性分析及二级结构预测所得到的结果相符，仅tFold预测结果在C端116-142位氨基酸残基增加了部分β-折叠区域。

最后，我们对与Neuritin相互作用蛋白进行了预测和分析，众所周知，蛋白质相互作用是蛋白质分子发挥其生物学功能的主要方式，构建蛋白质相互作用网络有利于明确与目的蛋白有相互作用的分子，这为研究目的蛋白的生物学功能和发挥生物效应的机制提供重要依据。Neuritin主要具有抑制细胞凋亡、促进神经突起的生长及其分支形成、促进突触的发育成熟并维持突触的可塑性，维持神经元的存活的作用［4-6］，但尚未明确其发挥作用的受体及具体机制。本研究利用数据库按照置信度从高到低选取10个蛋白构建Neuritin相互作用蛋白网络，主要包括Gria蛋白家族，OLFM蛋白家族及Cacng2等，其中，Gria家族成员（Gria 1、2、3、4）为谷氨酸AMPA离子通道型受体，在中枢神经系统中起配体门控离子通道的作用，在兴奋性突触传递中起重要作用［18］。有趣的是，Subramanian等［19］发现Neuritin可促进兴奋性突触的稳定及成熟，Neuritin利用其GPI锚与AMPA受体发生相互作用，促进新生棘突的稳定与突触成熟。Cacng2是一种电压依赖性钙通道蛋白，主要参与细胞内钙通路以及谷氨酰胺信号通路［20］。无独有偶，Zhao等发现Neuritin可增强胞内钙水平，上调细胞表面Cav1.2及Cav1.3的表达，此过程受胰岛素受体（IR）、ERK以及钙调神经磷酸酶（CaN）介导［21］。Dlg4属于膜关联鸟苷酸激酶蛋白家族，与 NMDA 受体信号传导相关的突触可塑性有关。Dlg4表达异常会改变海马神经元中兴奋性突触与抑制性突触的比例［22］，而Neuritin可以激活ERK通路促进Cav3.3α表达，增加小鼠内侧前额叶皮质兴奋性突触后电流频率和谷氨酸释放，影响神经元兴奋性或突触活动，从而改变神经网络的兴奋性［23］。Olfm1、3是嗅素结构域家族（OLFM）中的成员，OLFM蛋白的生物学功能尚不清楚，但较多证据显示其可在正常发育和病理过程中起重要作用。Olfm1在小鼠视网膜中有表达，Olfm1的突变会阻断其分泌；抑制Olfm3及其同家族蛋白成员的活性，会导致视网膜病变［24-25］。有趣的是，有文献报道，Neuritin基因表达高峰出现在视觉发育关键期，同时其在受损视神经中表达上调［26］。综上，Neuritin蛋白可能通过与上述蛋白因子互作在神经元发育、突触可塑性、钙调通路以及视觉发育过程中发挥重要的作用，但具体机制仍需进一步研究证实。

本研究綜合多种生物信息学手段，探讨了Neuritin的基本理化性质及其结构组成，构建了高可信度的Neuritin相互作用蛋白网络，为研究其在神经退行性疾病中发挥作用的机制，探索Neuritin的作用靶点提供了新的思路与方向。

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（責任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-04-14

基金项目：国家科技重大专项（民口）重大新药创制项目（2019ZX09301-161）;浙江省重点研发项目（2019C03060）

作者简介：李煜（1997—），男，硕士研究生，专业方向为基础医学，e-mail：lybiochem@163.com。

*通信作者：杨磊（1962—），男，教授，博士生导师，从事蛋白质功能与疾病方面的研究，e-mail：20080009@hznu.edu.cn。