HPLC法测定石椒草中芦丁的含量

田树兴,马 健,周崇富,刘红光,李军山

(1.云南神威施普瑞药业有限公司,云南楚雄 675000;2.云南省中药配方颗粒工程研究中心,云南楚雄 675000;3.神威药业集团有限公司,河北石家庄 051430)

芦丁是一种天然的黄酮衍生物,也被称为芸香苷、槲皮素-3-芸香糖苷、槐糖苷、维生素 P等[1-3]。它具有抗氧化、抗心肌损伤、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[4-6]。关于芦丁含量测定的方法种类繁多,可通过多壁碳纳米管(MWCNTs)及羧甲基纤维素钠、二硫化锡、十六烷基三甲基溴化铵、羟基富勒烯和漆酶等构建电化学传感器或生物传感器,用于芦丁的超灵敏检测[7-9]。例如:乐薇等[10]通过壳聚糖基碳点纸芯片对槐米中芦丁含量进行快速检测;牛宏亮等[11]通过HPLC-MS/MS法对配制酒中的芦丁含量进行测定;严成等[12]以芦丁为对照品,通过紫外分光光度法对溪边凤尾蕨总黄酮进行测定。此外,也可通过高效液相色谱法对芦丁进行含量测定[13-14]。

石椒草为芸香科植物石椒草BoenninghauseniasessilicarpaLévl.的干燥全草[15],别名九牛二虎草、铜脚一枝蒿、白虎草、羊膻草,分布于四川、云南等地[16-17],具有清热解毒,行气活血等功效,常被用于感冒、乳蛾、痄腮、肺热咳喘、脘腹胀痛、肾盂肾炎、脱疽、腰痛、跌打损伤等病症[18-19]。石椒草收载于《云南省中药材标准》,其中仅有几个简单的检查项目,未规定含量测定项[20]。有学者从石椒草水煮液中分离得到芦丁、石椒草碱[21];赵树年等[22]从石椒草精油中鉴定出松油烯-4-醇等33种成分;陈于澍[23]用乙醚从石椒草的全草中提取并分离出二十八烷醇等5种化合物;尹连红等[24]采用高速逆流色谱法从石椒草中分离制备高纯度芦丁。但是,关于石椒草中芦丁的含量测定,目前国内外均未见报道,因此有必要建立石椒草中芦丁的含量测定方法。由于高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)具有分析精度较高、分析速度快、重复性好等优点,故本文通过超声提取,采用HPLC法对石椒草中芦丁含量进行定量分析,以期为石椒草的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪 器

Agilent 1200高效液相色谱仪(安捷伦科技公司提供);SK250LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司提供);XPE 26电子天平(d=0.001 mg,瑞士梅特勒公司提供);TU 1901双束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司提供);Milli-Q IQ 7000超纯水机(德国默克密理博公司提供)。

1.2 材 料

石椒草购自禄丰县勤丰镇恒康中药经营部(产地分别为云南楚雄、云南安宁和云南禄丰),经河北省药品检验研究院孙宝惠主任鉴定为芸香科植物石椒草BoenninghauseniasessilicarpaLévl.的干燥全草。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院提供,批号为100080-202012,纯度为91.6%);甲醇(色谱纯,德国默克集团提供);冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司提供);实验室用水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇-1%(体积分数,下同)冰醋酸溶液(体积比为30∶70);柱温为25 ℃;检测波长为257 nm;流速为1.0 mL/min;进样量为10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取石椒草粉末(过4号筛)约1 g,精密称定,加75%(体积分数,下同)的甲醇20 mL,超声(功率为500 W,频率为40 kHz)处理30 min,取出放至室温,用75%的甲醇补足减失的质量,摇匀,用0.45 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液,同法制备阴性样品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品20.380 mg,置20 mL的量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,作为对照品储备液,精密吸取对照品储备液1 mL置10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,作为对照品溶液(其质量浓度为93.34 μg/mL)。

2.4 专属性试验

取上述供试品、对照品和阴性样品溶液,按照“2.1”项色谱条件测定,结果见图1。芦丁的理论塔板数为n=5.54(tR/Wh/2)2,其中:n为理论塔板数;tR为保留时间;Wh/2为半高峰宽;分离度R=2(tR2-tR1)/(W2+W1),其中tR2和W2分别为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间及峰宽,tR1和W1分别为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间及峰宽。结果详见表1。该色谱条件能对供试品中芦丁有较好的分离度,分离度大于1.5,且达到基线分离。

表1 理论塔板数及分离度

图1 石椒草HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Boenninghausenia sessilicarpa Lévl.

2.5 线性关系考察

精密吸取“2.3”项芦丁对照品溶液1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5 μL,注入高效液相色谱仪,分别测定峰面积,以峰面积为纵坐标(Y),对照品进样量为横坐标(X),绘制标准曲线,得到芦丁回归方程Y=2 182 623.0X+38 076.2,R2=0.999 2,表明芦丁进样量在0.093 34～1.166 75 μg时与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取按照“2.3”项制备的芦丁对照品溶液10 μL,连续进样6次,分别测定峰面积,计算得到RSD为1.04%,表明仪器的精密度良好,具体测定结果详见表2。

表2 仪器精密度测定结果

2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL,在0,4,8,12,16,20,24 h分别进行测定,结果显示24 h内峰面积无明显变化,计算得到RSD为1.11%,表明被测样品在24 h内稳定性良好,具体考察结果详见表3。

表3 稳定性考察结果

2.8 重复性试验

取同一批样品(产于云南禄丰)6份,按“2.2”项方法分别制备供试品溶液并进行测定,计算得到RSD为0.55%。结果表明测定方法的重复性良好,具体考察结果详见表4。

表4 重复性考察结果

2.9 加样回收率试验

取已知芦丁含量的适量样品(产自云南禄丰),约0.6 g,共6份,芦丁的质量分数为2.274 mg/g,精密称定,分别加入质量浓度为1.400 4 mg/mL的芦丁对照品溶液1 mL,挥干溶剂,按“2.2”项方法制备供试品溶液。按上述色谱条件进样测定芦丁含量,计算回收率,结果详见表5。

表5 加样回收率试验结果

2.10 色谱柱耐用性试验

分别用Thermo Acclaim TM 120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱(美国赛默飞世尔科技公司提供)和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱进行芦丁含量的测定,考察其耐用性,结果显示2种色谱柱均能取得较好的分离效果,耐用性良好。

2.11 样品含量测定

分别取不同产地的石椒草,按“2.2”项方法制备供试品溶液,并进行芦丁含量的测定,结果详见表6。

表6 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 流动相的选择

HPLC法测定芦丁含量大多采用甲醇-冰醋酸、磷酸或乙腈-磷酸溶液[25]。本研究选用甲醇-1%冰醋酸溶液为流动相,并在比例上进行优化,以甲醇与1%冰醋酸溶液的体积比分别为32∶68,30∶70,28∶72进行比较,结果显示体积比为32∶68的样品主峰分离度较差,体积比为30∶70和体积比为28∶72的样品分离度较好,且基线波动小,但体积比为28∶72的样品主峰保留时间较长,故选择体积比30∶70的甲醇-1%冰醋酸溶液作为流动相。

3.2 波长的选择

Agilent 1200 Series高效液相色谱仪DAD检测器的波长范围为200～400 nm。通过紫外可见分光光度计对对照品溶液进行波长扫描,发现芦丁在257 nm和359 nm有较大吸收,257 nm比359 nm的吸收值更大,波长扫描结果见图2。综合分析,在257 nm波长下的色谱图基线平稳,杂峰少,故选择257 nm进行检测分析。

图2 芦丁的波长扫描图Fig.2 Wavelength scan of rutin

3.3 色谱柱的选择

对比发现,使用Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色谱柱均能取得较好的分离效果,但Thermo AcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为长柱,出峰时间较晚。从节约能源和时间的角度考虑,选择Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)作为测定用色谱柱。

3.4 提取溶剂的选择

分别采用体积分数为25%,50%,75%的甲醇溶液,以及纯甲醇作为提取溶剂,并对提取效果进行比较。结果显示,25%甲醇溶液的提取率较低,50%甲醇和纯甲醇的提取率相近;75%甲醇的提取率最高,且对芦丁含量的测定无干扰,基线平稳,故选用75%的甲醇溶液作为提取溶剂。

3.5 提取时间的选择

分别对超声提取时间为10,20,30,40,50 min制备的供试品进行考察,结果显示超声提取10 min和20 min的样本芦丁提取率较低,而超声提取30,40和50 min的样本芦丁提取率相近,故选择超声提取时间为30 min。

4 结 语

本文利用HPLC法测定民族药石椒草中芦丁的含量,分别对流动相、检测波长、色谱柱、提取溶剂及提取时间等进行考察,最终确定了HPLC法测定民族药石椒草中芦丁含量的最优条件,即以甲醇-1%冰醋酸溶液(体积比为30∶70)为流动相,柱温为25 ℃,检测波长为257 nm,流速为1.0 mL/min,进样量为10 μL。结果表明,当芦丁含量为0.093 34～1.166 75 μg时与峰面积会呈现良好的线性关系,此时R2为0.999 2,平均回收率(n=6)为99.49%。该方法准确可靠,且具有分离度好、灵敏度高、准确性高、供试品制备简单等优点,可为石椒草质量评价及标准提升提供可靠依据。

由表6可知,3种不同产地的石椒草中均含有芦丁,但不同产地的石椒草中芦丁含量的差别较大。这与文献研究结果相一致,不同的产地、采收期、采收部位及加工方式,其药材中有效成分的含量有较大差异[26-30]。未来应继续深入研究不同产地、采收期、采收部位及加工方式等对石椒草中含量的变化差异,以利于石椒草的质量控制及保证临床疗效。